热敏肠毒素促进产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附的初步研究.pdfVIP

中国动物传染病学报 2012，20(6)：29—35 ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases · 研究论文 · 热敏肠毒素促进产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞 系IPEC．J2的黏附的初步研究 郁 磊 ，吴娟 ’朱国强 (1．扬州大学兽医学院，扬州225009；2．南京农业大学动物医学院，南京210095； 3．南京天邦生物科技有限公司，南京211102) 摘 要 ：本试验利用PCR技术，以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出热敏肠毒素 (heat．1abiletoxins，LT)基因， 大小约1．1kb。将其克隆入表达质粒载体pACYC184，构建和筛选出含正确插入LT基 因的pACYC．LT重组质粒。采用同样方法， 构建和筛选出两种含点突变LT基因的重组质粒 (pACYC—LT72和pACYC．LT192)。进一步将上述重组质粒DNA转化入不表 达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GM1一ELISA结果表明，上述重组菌均能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞 系IPEC．J2为模型，比较 了表达和不表达LT的细菌对细胞黏附性能。数据表明，LT的表达使细菌对肠上皮细胞的黏附效应明 显增加 (12．3±3．4倍 )。两种LT毒素蛋白的单氨基酸突变体的表达证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠 细胞的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp．cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂DDA和LT毒素的受体GM1都可阻断LT 毒素对细菌黏附性能的提升作用。 关键词：热敏肠毒素；黏附；IPEC—J2 中图分类号：$852．612 文献标志码 ：A 文章编号：1674—6422(2012)06．0029．07 HEAT_LABILEENTERoToXIN ENHANCESETECADHERENCETo PoRCINESMALLINTESTINEEPITHELIALCELLLINE IPEC．J2 YU Lei ，W U Juan ，ZHU Guo—qiang {i．CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China,2．CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculture University,Nanjing843300,China,。3．ChineseAnimalDiseaseControlCenter,Nanjing211102．China) Abstract：TheLT genewithsizeof1．1kbwasamplifiedinPCR usingthegenomicDNA templateofK88acE colistrainC83902． ThePCRproductsweredigestedwithhterestrictionenzymesateachendandthenclonedintovectorpACYC184．TherecombinantLT plasmidswerethenconstructedandconfirmedbyrestrictionendonucleaseanalysis．Inaddition．twoLT variantsfpACYC一【72and pACYC-I 192)werealsoconsturcted，eachbearingmutationsofaminoacidresiduesintheAsubunitfA72RandR192G1thatrendered htetoxininactive．TheLTexpressionwasconfimr edinGM 1一ELISA ．Porcinesmallintestineepithelialcell1ineIPEC—J2withglycoprotein receptorsforbacterialin vitroadhesionwaspreparedandusedinthestudy．ThedatademonstratedthatelaborationofLTp