基于脂肪酸生物标记的柑橘黄龙病11L-8-s芦柑.docVIP

基于脂肪酸生物标记柑橘黄龙病植株叶片内生菌聚类分析利用脂肪酸生物标记（PLFA）分析柑橘黄龙病植株有病症和无病症叶片内生菌群落结构特征。结果表明：不同品种、不同发病状态柑橘黄龙病植株PLFA种类和含量不同。芦柑黄龙病植株叶片中PLFA分布量最大，福橘黄龙病植株有/无病症叶片中PLFA分布量次之，脐橙黄龙病植株有病症叶片中PLFA分布量最小。基于脂肪酸生物标记对柑橘材料进行聚类，结果显示，不同品种柑橘不同发病状态叶可聚为3个类群，相同品种的不同发病状态柑橘叶聚在同一类群，说明柑橘植株内生菌种群结构与品种关系更为密切，与植株发病状态关系不紧密。 图1 典型黄龙病症状柑橘植株叶片 1.2柑橘内生菌脂肪酸生物标记分析方法 柑桔植株内生菌PLFA的提取步骤如下：称取10g柑桔植株不同部位（根、茎、叶）于研钵中，用液氮研磨成粉状，装入50mL离心管中，加入20 mL 0.2mol·L-1KOH甲醇溶液，充分混匀，100℃水浴10min（此过程为避免管内液体沸出，可先不盖离心管盖子，用保鲜膜封住管口）；加入3 mL 1.0 mol·L-1的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀；加入10 mL正已烷2000r·min-1条件下 15min，将上层正己烷相转入干净玻璃试管中，吹干；加入0.6mL体积比为1:1的正已烷:甲基叔丁基醚溶液，充分溶解，转入GC小瓶，用于脂肪酸测定。 PLFA成份采用美国Agilent6890N型气相色谱仪在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：色谱柱lμL，100:1，载气（H2）流速为2mL· min-1，尾吹气（N2）流速为 30mL·min-1。5℃ min-1的速率使柱温由170260℃；再以40℃ min-1的速率升温至310℃，保持90s。250℃，检测器温度为300℃，柱前压l0.00 psi(1psi= 6.895kPa)。脂肪酸成份分析采用微生物自动分析仪（Sherlock MIS美国MIDI公司生产）：系统根据各组分保留时间计算等链长(ECl)值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。 1.3 数据分析 （1）以为样本，以各在与否为指标，植株脂肪酸测定从柑橘黄龙病植株叶片共检测到5个PLFA标记，其中福橘黄龙病植株叶片检测37个生物标记个生物标记脐橙黄龙病植株叶检测到41个生物标记，个生物标记雪柑黄龙病植株叶片检测40个生物标记，个生物标记芦柑黄龙病植株叶片检测37个生物标记PLFA含量不同，芦柑黄龙病植株叶片中PLFA分布量最大，为5210015，福橘黄龙病植株叶片中PLFA分布量次之，为43777744138061，脐橙黄龙病植株叶片中PLFA分布量小，2192702。生物标记12:1 at 11-12、11:0 iso 3OH、11:0 2OH、13:0 iso、12:0 2OH、14:1 w5c、14:00、15:00、16:1 w9c、15:0 iso 3OH、17:0 anteiso、17:1 w8c、17:00、18:1 iso H、18:0 iso、18:1 w5c、18:00、18:0 10-methyl和20:0 iso在几个柑橘品种的黄龙病植株叶片上均有分布，为完全分布。生物标记15:1 iso只在福橘黄龙病植株叶中分布，14:0 iso只在雪柑黄龙病植株叶分布、16:1 w7c alcohol只在脐橙黄龙病植株叶分布，19:0 cyclo w8c只在芦柑黄龙病植株叶分布，这类脂肪酸生物标记为不完分布。 生物标记 Biomarkers 微生物类型 PLFA含量 福橘黄龙病有病症叶 福橘黄龙病无病症叶 脐橙黄龙病有病症叶 脐橙黄龙病无病症叶 雪柑黄龙病有病症叶 雪柑黄龙病无病症叶 芦柑黄龙病有病症叶 10:0 2OH 细菌 21436 39459 74865 37123 96361 43538 0 10:0 iso 0 0 3519 12713 17466 17712 0 5339 0 0 0 0 5339 0 0 12:0 iso 0 0 2425 0 5220 0 0 12:1 at 11-12 假单胞杆菌 114584 89769 31239 31301 20901 30719 157592 12:0 0 0 29203 22754 16921 15463 0 11:0 iso 3OH 细菌 39514 32406 1292 1016 3788 1271 31693 11:0 2OH 革兰氏阳性细菌 660201 577393 5447 6366 18432 9282 373210 13:0 iso 革兰氏阴性细菌 26368 12802 5149 4200 2033 1204 14915 1