免疫组化染色对照的方法目的排除假阳性或假阴性（非特异性.pdfVIP

免疫组化染色对照的方法 * 目的 * 排除假阳性或假阴性 * （非特异性染色或交叉反应） * 正确评价免疫组化染色结果 阴性对照用确知不存在相应靶抗原的组织标本染色，结果应为阴性 * 空白对照 * 替代对照 * 抑制试验 * 吸收试验 * 阳性对照用已经证实含有靶抗原的组织切片与待检标本同样染色，结果应为阳性 * 自身对照 空白对照 * 用磷酸缓冲液(PBS)替代第一抗体 （特异性抗体 ） * 假阳性原因 * 自发荧光，色素及内源性酶 * 第二抗体或桥抗体 * PBS 替代— 阴性 * 无关血清 （羊抗兔）替代— 阴性 替代对照 * 用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体，染色结果应为阴性 * 保留免疫前动物的血清 * 用未经免疫的同种动物血清或正常血清替代第一抗体 * 排除非特异性染色 （坏死组织、嗜酸性粒细胞及胶原组织吸附Ig ） 抑制试验 * 待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色，结果明显减弱或转阴性 * 两步抑制试验 * 待检组织切片两张，一张先加未标记特异性抗血清，后加标记特异性抗血清，染色被抑制 （阴性） * 另一张先加未标记同种正常血清，后加标记特异性抗血清，未起封闭作用，阳性染色 抑制试验 * 一步抑制试验 * 将标记抗体和未标记抗体混合 （等量或１：９）后染色，对照组用标记抗体与PBS 混合，对照组染色 强 吸收试验 * 用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能 再与组织内的抗原反应，染色结果应为阴性 * 使用一种新的抗血清和对新的组织标本染色时，应做吸收试验。但抗原不易得到，所以少做 阳性对照 * 用已经证实含有靶抗原的组织切片与待检标本同样染色，结果应为阳性 * 排除待检标本假阴性的可能 * 阳性对照片阴性－抗原保存、染色方法与抗体效价 自身对照 * 用同一组织切片或涂片上与靶抗原无关的其他结构做对照 * 阴性部位可用于阳性自身对照；如靶抗原与血细胞无关，则可用内源性过氧化物酶做阳性对照 免疫组化染色对照设计注意点 * 每次试验同时做阳性对照和阴性对照 * 阴性对照应同时做空白对照和替代对照 * 间接法第一抗体阴性对照结果阳性时，应考虑第二抗体或桥抗体的替代对照 * 阳性对照 空白对照 替代对照 待测切片 结果判断 * （- ） （- ） （- ） （- ） 抗体失活或操作有误 * （+ ） （+ ） （+ ） （+ ） 非特异性染色 * （+ ） （- ） （+ ） （+ ） 非特异性染色 * （+ ） （- ） （- ） （- ） 阴性结果可靠 * （+ ） （- ） （- ） （+ ） 阳性结果可靠 1 * 非特异性染色及消除方法 非特异性染色