显微注射用BACDNA的制备.pdfVIP

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显微注射用BAC DNA 的制备 用于显微注射的DNA 的纯度对于成功产生转基因小鼠是极其关键的。细菌内毒素或有机 物污染都可能显著降低DNA 的整合效率和/或显微注射后胚胎的存活率。目前有许多方法可以 制备高纯度的BAC DNA ,为获得高纯度的BAC DNA ,保证显微注射服务的成功率,我们推 荐以下的制备方法。 由于BAC DNA 非常大且很容易被切断,所以在处理BAC DNA 时最重要的是尽可能地保 持轻柔的操作,包括慢慢地吸液,避免漩涡并避免冻存。当吸取BAC DNA 时,可剪掉移液枪 头的尖端部分,这样在一定程度上可减少吸液过程中对DNA 的剪切。BAC DNA 在线性化后 的操作中要更加小心,因为线性化的BAC 比环状的BAC 更容易被切断。 注意:传统操作中研究人员常将用于注射的BAC DNA 线性化。然而越来越多的实验室不 再对BAC DNA 进行线性化,他们发现与对应的线性化BAC DNA 相比,环状的DNA 也可以 在转基因胚胎中获得相同的LacZ 染色模式。我们的研究也发现确实这样,环状BAC DNA 更 易于注射且可能产生更好的结果(更高频率的转基因胚胎)。因此我们推荐您考虑注射环状 BAC DNA ,这样也可以为您节省制备DNA 的时间。 推荐的BAC DNA 制备方法: 1)用以下任何一种试剂盒分离BAC DNA :NucleoBond PC 100 Kit (Clontech: Cat# 740573); 或 PowerPrep HP Maxiprep Kit with Prefilters (Marligen: Cat# 11476-025). 2 )如果您希望注射环状BAC DNA ,那么在最后一步您需要用BAC 注射缓冲液洗脱DNA 。 如果您希望注射线性化的BAC ,那么按以下步骤进行: A. 用限制性内切酶在约200 μL 的酶切体系中消化大约50 μg 的BAC DNA 。 B. 消化后通过Sepharose 4B-CL 柱纯化DNA ,可以在一支经硅化处理的(并烤干的)2 mL 玻璃移液管中制备纯化柱,玻璃移液管的末端敲掉一点点这样可以形成一个大一 点的孔。为了构建纯化柱,您可以用硅化处理的(并烤干的)玻璃丝来堵住移液管 的底部;同时在移液管的顶部系上一个10 mL 的一次性使用注射器的针筒作为缓冲 液贮容器。Sepharose 4B-CL 的珠子首先要用BAC 注射缓冲液清洗并平衡,依靠重力 排空纯化柱。纯化柱一旦排空,缓慢地将消化混合物加入到纯化柱中,随后慢慢加 1 / 2 入BAC 注射缓冲液进行洗脱。收集大约 12 个0.3 mL 的洗脱液。您可以手动完成操 作,这需要1~2 小时。洗脱下来的液体保存在4 ℃。 C. 每一部分取5 μL 点样到CHEF 凝胶上,并以已知浓度及大小的标准品做对照。如果 从消化液中能分离出BAC 载体骨架和目的片段,我们发现含载体片段的洗脱液为3 或4 部分,而含插入片段的洗脱液为6 或7 部分(部分的差异取决于插入片段的大 小)。具有最高DNA 浓度的这部分就是我们需要用的,通常浓度应高于50 ng/μL 。 3 )用分光光度计(例如NanoDrop )测量DNA 浓度。于4 ℃保存。 注意:客户需要向我们提供至少100 μL溶解在BAC 注射缓冲液中的DNA,且浓度不低于 40ng/μl,同时需要附上DNA 的凝胶电泳图片。DNA 的运输可以在室温下进行。 缓冲液配方: 1)BAC 注射缓冲液含有: - 10 mM Tris - 0.1 mM EDTA - 100 mM NaCl 2 )40 mL BAC 注射缓冲液的配制方法: - 1 M Tris-HCL, pH 7.4 (推荐Sigma 产品:Cat# T2663 ): 400 μL - 0.5 M EDTA (推荐Sigma 产品:Cat#E7889 ): 8 μL - 5 M NaCl: 0.8 mL - 加入高品质的蒸馏水至40 mL 注意:赛业生物转基因动物中心将在注射前加入多聚胺。

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