三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证.pdf

汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证摘要 三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum ) 已完成基因组测序, 具备成熟的遗传转化技 术, 是 海洋硅藻的模式种 。 由于 其生长快、 油脂含量高 (占细胞干重的 20%~50% ) , 具备 大规模培养的技术基础, 已成为微藻生物柴油研究的理想材料。 本文对其 三酰基甘油 (TAG ) 合成的关键基因 进行了克隆, 并在相应酵母缺陷型菌株中开展了功能验证, 进一步构建了 硅藻表达载体,完成了基因枪转化,取得进展如下: 1. 通过 RT-PCR 方 法 从 三 角 褐 指 藻 总 cDNA 中 克 隆 得 到 磷 酸 甘 油 酰 基 转 移 酶 1 (PtGPAT1 ) 基因的完整 cDNA 序列, 通过与 基因组序列比较分析, 发现该基因序列全长 1947 bp , 编码 648 个氨基酸, 基因组全序列共有 5 个外显子和 4 个内含子, 利用信息学方 法分析共有 6 个跨膜结构,分析该 GPAT 定位于内质网。 2. 针对 PtGPAT1 与 实验室之前克隆的二酰甘油酰基转移酶 2 基因 (PtDGAT2 ) , 构建 了酵母表达载体 pYGPAT1 与 pYDGAT2,导 入后 分别在 2 株 GPAT (Y13037 、Y15983 ) 和 1 株 DGAT (H1246 )缺陷型酵母菌株中进行 相关基因的功能验证。尼罗红染色观察显 示, PtGPAT1 在 2 种酵母 缺陷型转化子中的相对荧光值 均显著高于转化空白载体的 对照组, 证明 PtGPAT1 重组表达蛋白具备 磷酸甘油酰基转移酶 活性。 而 PtDGAT2 不能使 DGAT 缺 陷性酿酒酵母 H1246 回复突变 ,提示不具备二酰甘油酰基转移酶功能。 3. 针对 PtDGAT2 与 实 验 室 之 前 在 酵 母 中 已 验 证 功 能 的 二 酰 甘 油 酰 基 转 移 酶 4 (PtDGAT4 ) , 构建了硅 藻表达载体 pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar 和 pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar , 并完成了基因枪转化,后续抗性藻株的筛选与检测实验正在进行中。 本文首次对三角褐指藻的 GPAT 基因完成功能验证,相对荧光值半定量结果显示, PtGPAT1 可以显著提高酵母缺陷型菌株中的 TAG 含量, 提示 PtGPAT1 可以作为三角褐指 藻油脂代谢基因工程的重要靶基因。 构建了 PtDGAT2 与 PtDGAT4 的硅藻转化载体, 为 进 一步基因功能验证和 硅藻 油脂代谢基因工程奠定了必要基础。 关键词 :三角褐指藻; 磷酸甘油酰基转移酶 1;二酰甘油酰基转移酶 2 ;三酰基甘油 I汕头大学 三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证Abstract As a model of marine diatom research, Phaeodactylum tricornutum has been completed genome sequence, which has established successful genetic transformation system. Because of its high growth rate, rich lipid content 20%~50% of dry weight and large-scale culture technology foundation, it has been a perfect feedstock for microalgae biodiesel research. This thesis bases on cloning important enzymes in triacylglycerol TAG biosynthesis and their function-identified in defective-yeast strains, respectively. Then after construction of diatom expression vectors, gene gun transformation has been done. The main investigation results in this project are as follows:1. By using the method of RT-PCR, the whole cDNA sequence of glycerol-phosphate acyltransferase 1 PtGPAT1 gene has been cloned from to