同型半胱氨酸通过人端粒本科逆转录酶DNA去甲基化加速内皮衰老.pdf

摘 要 端粒 (t e l om e r e ) 是由 D N A 重复序列 和结合蛋白组成的复 合物结构 , 位于真核生物 染 色体末端。 它对于细胞增殖过程中基因组的完整性以及染色体末端 稳定性发挥着至关重要 的 作 用 。 越 来 越多 的 研 究 发 现 , 端 粒 D N A 长 度 以 及其 结 构 的 维 持 与 细胞 衰 老 密 切相 关 。 已 有 研 究 报 道 与 年 龄 相 关 的 血 管 内 皮 细 胞 ( e ndot he l i a l c e l l s , E C s ) 的 衰 老 和 功 能 障 碍 在 人 类动脉粥样 硬化引起的疾病中发 挥重要作用 。 高同型半胱 氨酸血症 ( hy p e r h om oc y s t e i ne m i a , H H c y ) 是动脉粥样硬化的一个独立危险因子 。 内皮功能紊乱在同型半胱氨 酸 (hom oc y s t e i ne , H c y ) 相 关 的 动 脉 粥 样硬 化 发 生 发 展 中 发 挥 重要 作 用 , 其 中内 质 网 应 激 、 氧化 应 激 、 炎 症 反应、 细胞凋亡和表 观遗传学调控 等参与了此过 程。研究显示 , H c y 可加速 内皮祖细胞或 内皮细胞衰老, 从而引起细胞功能障碍,然而, 其作用机制尚不明确 。 人端粒酶逆转录酶 (hum a n t e l om e r a s e r e ve r s e t r a ns c r i pt a s e , hT E R T ) 基因 可以通 过调控 端粒酶 的活 性以维 持端 粒 的 长 度 和 功 能 。 因 此 , 改 变 hT E R T 的 表 达 可 影 响 端 粒 的 长 度 , 进 而 影 响 细 胞 的 增 殖 和 寿命。有研 究报道, D N A 去甲基 化可使肿瘤 细胞中的 hT E R T 基因表 达下降,端 粒酶活性 降 低 甚 至 失 活 和 端 粒 长 度 缩 短 , 提 示 hT E R T 基 因 的 表 观 遗 传 学 修 饰 在 癌 变 过 程 中 起 重 要 作用。 我们之前的研究在体内体外发现 H c y 通过表观遗传学调控动脉粥样硬化基因, 从而 引起内皮功能紊乱, 这促使我们考虑到 H c y 是否通过通过表观遗传学修饰 hT E R T 的表达 , 进 而 影 响 人 血 管 内 皮的 衰 老 过 程 。 本 课 题 的 目 的 在 于 探 讨 H c y 对 血 管 内 皮 中 hT E R T 表 达 的调节机制及其意义, 以期进一步揭示 H c y 导致心血管疾病发生、 发展的分子机制 , 为临 床防治心血管疾病提供新的思路。 首 先 , 我 们 将 P 2- P 10 代 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 ( H um a n um bi l i c a l ve i n e ndot he l i a l c e l l s , H U V E C s ) 分别放 在正常内 皮细胞培养 基 (E ndot he l i a l c e l l m e di um , E C M ) 和含病 理生理浓 度状态下 H c y (25μ m ol / L ) 的 E C M 中持续培养 , 采用定量 P C R 法检测细胞衰 老标志物 P 1 6 和 P 21 , 以 及 代 表 端 粒 长 度 改 变 的 端 粒 与 单 拷 贝 基 因 的 比 值 ( T / S 比 值 ) 。 结 果 发 现 正 常 E C M 培养的 H U V E C s 中, P 16 和 P 21 m R N A 的表达水平在 培养 P 8 代开始明显增 加 , 端粒 长度则在 P 10 代开始缩短。 然而 , H c y 持续刺激的 H U V E C s 的上述基因表达的增加 和端粒 长度的缩短, 均较正常 E C M 培养时提前 2 代。 我们应用 β - 半乳糖苷酶染色检测发现从 P 6 代开始,H c y 导致的细胞衰老比例增加 。随后,采用实时定量 R T - P C R 和蛋白印迹法检测 hT E R T 的表达情况, 发现 H c y 在 m R N A 和蛋白水平均 下调 hT E R T 的表达。 而应用可逆 转H c y 导致的 D N A 低甲基化的 叶酸 (100 μ m ol / L ) 处理 H U V E C s 后, 可以在一定 程度上抑 制 H c y 引 起的 P 21 的 上调 , T / S 和 hT E R T 的 下降 ,并 降低 了衰 老细 胞的 比 例, 说明 D N A 甲 基 化 可 能 参 与 了 H c y 加 快 内 皮 衰 老 的 过 程。 为 了 进