实验一微生物细胞数的计数.docVIP

环境工程微生物学实验 实验一 微生物细胞数的计数 一、目的 了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。 二、仪器和材料 1、器材：显微镜、擦镜纸、吸水纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。 2、测试样品：酵母菌液（细菌悬液也可） 三、血球计数板的结构与计算方法 血球计数板（图1）是一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。中间的一个大方格为计数室，它的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。计数室有两种规格：一种是把大方格分成16中格，每一中格分成25小格，共400小格；另一种规格是把一大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下： 图1 血球计数板的结构图 （A—正面图；B—侧面图） 1、16×25的计数板计算公式 细胞数/mL＝（100小格内的细胞数/100）×400×10000×稀释倍数 2、25×16的计数板计算公式 细胞数/mL＝（80小格内的细胞数/80）×400×10000×稀释倍数 四、操作步骤 1、稀释样品，为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含5个细胞。 2、取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5～10min即可计数。 3、将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动细调节器，以便看到计数室内不同浓度的菌体。现以16×25规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100小格）的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格（即80小格），对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的菌数。 4、测数完毕，取下盖玻片，用清水把血球计数板冲洗干净，用吸水纸轻轻吸去计数室内的水分，再用擦镜纸小心地吸干计数板（注意勿使网格受到磨损），然后放入盒内保存。 五、实验报告 计算并报告所测样品每毫升（克）的含菌数。实验 培养基的制备和灭菌 一、目的 1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 2、掌握培养基和无菌水的制备方法。 3、掌握高压蒸气灭菌技术。 二、仪器和材料 1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂或市售营养琼脂培养基、蒸馏水、10%HCI、10%NaOH 2、器材：培养皿（直径90mm）10套，试管(15 mm×150 mm)5支，(18 mm×180 mm)5支，移液管(10 mL)1支，(1 mL)2支，锥形瓶(250 mL)2个；烧杯(300 mL)1个，玻璃珠30粒、纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）、精密pH值试纸6.4～8.4、高压蒸气灭菌锅、烘箱、酒精灯。 三、实验内容 1、玻璃器皿的洗涤和包装 （1）洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。 （2）包装 ①移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1～1.5cm长的棉塞（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内）。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30o夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。 ②用棉花将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住 棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆形，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有皱褶，以防空气中微生物沿棉塞皱褶侵入。棉塞插入2/3，其余留在管口（或瓶口）外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包并用细绳或橡皮筋捆扎好放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。 ③培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对）包好。 2、培养基的制备 培养基是微生物的繁殖基地。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养物配制而成。其中含水分、碳化合物、氮化合物、无机盐等，这些营养物可提供微生物碳源、能源、氮源等，组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同，或培养不同种类微生物可配成各种培养基。通常培养细菌是用肉膏蛋