辐射制备M-PEIs基因转导载体细胞生物学研究.pdfVIP

第 31 卷 第 6 期 核 技 术 Vol. 31, No.6 2008 年 6 月 NUCLEAR TECHNIQUES June 2008 辐射制备的M-PEIs 基因转导载体细胞生物学研究 董 黎 徐冬梅 洪 军 宫培军 姚思德 （中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800 ） 摘要 将辐射制备的 M-PEIs 纳米凝胶转导质粒短发夹状 RNA (shRNA) ，研究了载体复合物的细胞毒性、 shRNA 转染效率及对靶基因的表达抑制。结果表明 M-PEIs 纳米凝胶的细胞毒性较低，可以较高基因转染 效率将 shRNA 转移到细胞内，同时携带的质粒 shRNA 在靶细胞内具有较长的释放期，转染的 shRNA 能使 肝癌细胞的靶基因失活，有效抑制了靶基因的表达，初步证明辐射制备的 M-PEIs 纳米凝胶是一种有效的基 因治疗载体。 关键词 辐射制备，聚乙烯亚胺，基因载体，短发夹状 RNA 中图分类号 Q782 ，R329. 26 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年 的细胞毒性[10-11]，有关其细胞毒性仍有争议。本文 来其发病率和死亡率有逐年升高的趋势。随着肿瘤 采用本实验室辐射法制备的粒径可控 M-PEIs 纳米 放射物理学和生物学的发展，放射治疗已成为治疗 凝胶，使其携带 shRNA 并转染人肝癌细胞，考察其 肝癌的常用手段。常规放射治疗缺乏肿瘤靶向性， 基因转染效率与细胞毒性，并评估了 M-PEIs 转导 而肝脏是辐射敏感器官，难以耐受高剂量照射，肝 的 shRNA 对肝癌细胞内相应靶基因 OPN 的抑制作 硬化患者对射线的耐受性则更差。三维适形放射治 用，以探讨 M-PEIs 作为基因传导载体的可能性。 疗对肝脏局部照射，减少了对正常肝脏组织的辐射 损伤，但疗效并不理想[1] 。对肿瘤较大或发生转移 1 材料与方法 者，放射治疗仅有一定的姑息疗效。 1.1 材料 因肝癌初诊时多为晚期，且具有侵袭性强、易 复发、转移等生物学特性，大多伴有肝硬化，对治 肝癌细胞 HepG2 购自复旦大学中山医院肝癌 疗耐受性差，目前实行的手术、放疗、化疗、中医 研究所。转染试剂 jetPEI™ ，购自法国 Polyplus 公 中药治疗等的效果均不理想，因此需要探索新的治 司。RNA 提取试剂盒，cDNA 逆转录试剂盒购自上 疗手段。 海申能博彩生物公司。OPN 第一抗体购自美国RD RNA 干扰(RNA interference)是近年来出现的一 公司。MTS 试剂盒购自美国 Promega 公司。 种基因沉默技术，能快速、高效地抑制瘤细胞或组 1.2 方法 织中异常或突变蛋白的表达[2-4] 。用 shRNA 特异性 地抑制肿瘤发生和转移相关的基因表达，还可用来 1.2.1 辐照法制备 M-PEIs 按照研究工艺，在柱状 提高化疗和放疗的效果，有望用这种新的手段治疗 烧瓶中的定量三蒸水中加入定量 PEI 预聚物，用盐 各种恶性肿瘤。但是目前仍然有一些关键问题阻碍 酸调节溶液 pH 至 5.0，加入定量 FeCl2 溶液，机械 其临床应用，合适的基因载体是其亟待解决的问题 搅拌，取一定量的样品放入辐照管中，在 1.72× 1015 之一。