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ISSR分子标记与其在银杏系统分类研究上的应用 姓名：程勤贤 学号：03234 导师：陈鹏 单位：扬州大学 地址：农学院园艺系 邮编：225009 摘要:DNA分子标记技术近年来被广泛应用于植物的遗传多样性研究、品种鉴别、良种选育、基因定位及资源分类等,大大推动了这些领域的发展。该文介绍了ISSR技术的原理及其操作，并综述了ISSR在银杏遗传变异、系统分类及进化和杂种鉴定中的研究进展。 关键词: 银杏，ISSR，系统分类 银杏(Ginkgo biloba)是裸子植物银杏纲中唯一现存的中生代孑遗植物。雌雄异株,染色体数目为2ｎ=24(陈学森等,1996)。银杏对气候的适应性较强,分布于温带、暖温带和亚热带地区。由于银杏叶和种子具有非常重要的药用价值以及其种子的可食性,银杏在中国被广泛栽培,至今已有近1000年的栽培史(Dell Tredici et al,1992)。现栽培银杏分布于我国的24个省区,国外现栽培的银杏都源自中国(林协,1965)。我国银杏资源非常丰富,但并非取之不竭,个体之间的亲缘关系的鉴定可以为合理有效的利用银杏资源及培育新品种提供基础,有益于整个银杏产业的可持续发展。同时了解植物亲缘关系还可以阐明植物界的自然系统,这也是植物分类学的任务之一，是保护生物遗传多样性的重要部分。 作为单科属植物,由于长期的天然杂交和人工选择, 银杏的种子和叶片发生了明显的变异,根据这些变异,有的学者在种之下划分了变种、变型和类型。不同的学者从不同的变异角度考虑就有不同的品种划分。Carriere根据银杏冠形和枝、叶形态、叶的大小和颜色将银杏划为8个种，有垂枝银杏，裂叶银杏，斑叶银杏，黄叶银杏，叶籽银杏等；曾勉根据银杏种子大小和形状将银杏分为3个变种；何凤仁根据银杏种核的长度比例和两个中轴线交会点的位置划为5大类,长子、佛子、马铃、梅核、圆子，每类包括若干品种。这些分类方法为银杏研究和生产解决了许多基本问题，但是这些传统的形态学分类法如植物解剖学、植物胚胎学、孢粉学、植物化学、细胞学基本上停留在表型水平，这往往受环境因素、发育阶段等条件的限制，鉴定结果不可靠。 DNA分子标记技术是近年来才应用于植物分类研究的, 它从分子水平上直接检测其差异，标记数量是无限的，而且稳定性高。与其他分类方法相比分子标记具有以下优点:①直接以ＤＮＡ的形式表现,不受组织特异性、发育阶段、季节、环境等限制;②数量多,遍及整个基因组;③多态性高;④表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁;⑤有些分子标记表现为共显性,能够鉴别物种的杂合、纯合状态.近年来,该技术发展迅猛,成为研究林木系统的有力工具。目前广泛应用的分子标记主要有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism ) 限制性片段长度多态性,RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs) 随机扩增多态性ＤＮＡ,AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism即扩增片段长度多态性),SSR(Simple Sequence Repeats) 简单序列重复亦称微卫星,ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 锚定微卫星即简单重复间序列 ,和SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性。 其中ISSR作为一种新型的分子标记技术已经在植物的群体、个体遗传变异及系统分类与进化中得到了很好的应用。 ISSR的技术原理 ISSR（inter-simple sequence repeat）标记即简单重复间序列，是Zietkiewicz等（1994）发展了一种新的分子标记。基因组中分布有大量的重复序列，根据其在基因组中的含量可将其分为轻度、中度和高度重复序列，根据其分布特征可分为散在重复序列和串联重复序列，微卫星（即SSR）是一种高度串联重复序列，重复基序仅2～6bp，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于基因组中，正是基于基因组这种特点才出现了SSR和ISSR技术。 ISSR分子标记是在 SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在 SSR的5’或 3’端加锚 l～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。 图1 锚定ISSR-PCR示意图 在SSR的3,端或5,端锚定1-4个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了SSR在基因组上的滑动大大提高了PCR扩增的专一性。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，它在引物设计