AMPKα2基因shRNA重组质粒的构建以及在氯离子介导的大鼠心肌缺氧／复氧损伤中的作用.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology2012，28(12)：2113—2118 · 2ll3 · [文章编号] 1000—4718(2012)12—2113—06 · 论 著 · A 基因shRNA重组质粒的构建以及 在氯离子介导的大鼠心肌缺氧／复氧损伤中的作用 刘 丹 ， 孙 惦 ， 许 曼 ， 周 敏 ， 吴晓牧 ， 何 明 (南昌大学医学院，江西省人民医院神经内科 ，江西 南昌330006) [摘 要】 目的：构建 AMP活化的蛋白激酶 亚基 (AMPKa2)基因shRNA重组表达质粒，转染 H9c2心肌 细胞，探讨其在氯离子(CI一)介导的心肌细胞缺氧／复氧(AZR)损伤中的作用。方法：构建靶向AMPKa2基因的 shRNA重组质粒 pSuper—AMPKa2shRNA，转染H9c2细胞；Westernblotting法测定 AMPKot2的蛋白表达情况。实 验分5组，每组重复6次：(1)Control组；(2)A／R组；(3)Cl一一freeA／R组；(4)pSuper+c1一一freeA／R组；(5)pSu· per～AMPKa2shRNA+cl一一freeA／R组。处理结束后 ，生化 自动分析仪测定 LDH活性 ，MTF法测定细胞存活率， 流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(ROS)水平，试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH—Px)活性。结果：重组表达质粒 pSuper—AMPKa2shRNA经测序证明构建正确；转染心肌细胞后，AMPKot2 蛋白表达明显下降；C1一一freeA／R组较之A／R组细胞存活率升高，LDH含量下降，细胞凋亡减少，ROS生成减少， SOD和GSH—Px活性增加；转染pSuper—AMPKa2shRNA质粒后，阻断了cl一一free液的保护作用，且ROS生成增 加，SOD和GSH—Px活性也下降。结论：成功构建pSuper—AMPKct2shRNA重组质粒。AMPKot2基因沉默阻断了 cl一一free液对心肌细胞A／R损伤的保护作用。 [关键词】 AMP活化的蛋白激酶o2【亚基；氯；缺氧／复氧损伤；细胞凋亡；氧化性应激 [中图分类号】 R363 [文献标志码】 A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．12．001 EffectofAMPKa2genesilencingbyshRNA recombinantplasmidonchlo— ride—-mediatedanoxia／reoxygenationinjuryinratcardiomyocytes UU Dan 。SUN Dian ．XU Min 。ZHOU Min 。WU Xiao—mu ，HEMing (MedicalCollegeofNanchangUniversity，DepartmentofNeurology，JiangxiProvincialPeople’sHospital，Nanchang 330006．China．E—mail：wuxm79@163．com：jxhm56@163．con) A『BSTRACT1 AIM ：ToexploretheroleofAMP—activatedproteinkinasea2subunit(AMPKa2)geneinchlo— ride—mediatedanoxiafreoxygenation(A／R)injurybytransfectionofshort—hairpinRNA(shRNA)expressionvectortar- getingtoAMPKa2 gene intoH9c2 cardiomyocytes．METHODS：RecombinantshRNA expression vectorpSuper— AMPKa2traget