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第三章 染色体分析相关的实验 目前染色体的研究几乎深入到每个学科的每一个领域，染色体是把细胞与分子联系起来的重要桥梁，故在遗传学研究中或者在医学研究中被广泛重视及应用。几年相继出现了脆性位点热点、重排与癌基因激活及抑癌基因丢失，癌基因定位、抑癌基因定位及杂合位点缺失等与染色体相关理论染色体分析相对较简单细胞通常采用循环血中的淋巴细胞胎儿采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞细胞经过培养再用植物凝集素PHA）刺激细胞分化当每个染色体都复制成两个染色体单体时随后加入秋水仙素在分裂中期阻止细胞有丝分裂位于载玻片上的细胞随后被染色在显微镜下拍照或用计算机进行图像分析根据染色体形态大小,剪下照片上的染色体按序分类排贴在纸上,进行核型分析染色体显带通常通过G或Q荧光染色技术进行增加其他染色方法可提高细胞遗传学诊断的准确性新的分子生物学技术使用DNA探针(含有荧光标记)来定位染色体上特定基因和DNA序列荧光素标记的原位杂交技术可用于鉴别基因结构和寻找染色体缺失重排及复制01％的秋水仙素1～2滴（7号针头）加入培养瓶内，轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养2～4h。 （三）收获 1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入刻度离心管内，相对离心管平衡后放入离心机，离心8min（1000转/分），吸去上清液，留下沉淀物。 2．低渗处理：加8ml预温（370C）的0.075mol。L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬 浮于低渗液中，放回37℃恒温水浴锅中，静置15～20min，使白细胞膨胀，染色体分散、 红细胞解体。 3．预固定：加入固定液1～2ml打匀。 4．再离心：1000转/分离心8min，吸去上清液，留下沉淀物。 5．固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀，固定30min。 6．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液，留下沉淀物。 7．再固定：再加入新配固定液8ml，打匀，静置30min。 8．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液。 9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打匀成细胞悬液。 10．制片：用滴管吸细胞悬液2～3滴，滴在冰水预浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，在酒精灯上过几次，吹风机吹干或气干。 11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸缓冲液为1∶9）染色10 min～20min、自来水冲洗、晾干。 （四）镜检 低倍镜下找到分散良好的分裂相后，换高倍镜、油镜、认真观察。 （五）注意事项 1．PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。 2．浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。 3．秋水仙素溶液浓度和处理时间。一般最终浓度每毫升培养液0.1～0.2μg为宜，作用时间为3～5h，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系。如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊。 4．培养温度应严格控制在37℃+0.5℃。 5．双蒸水必须用玻璃蒸馏器制备，pH应在6～7之间。 6．低渗步骤极为重要，关系到染色体分散的好坏，因此，低渗液浓度与低渗的时间应掌握适当。 7．离心机最好用水平式的，速度不宜过快。速度太快细胞团不易打散，反之分裂相易丢失；固定液应在临用时新鲜配制，固定一定要彻底、均匀。若打散不够，则细胞在玻片上易集结。 8．若吹打时用力过猛，细胞易破碎，以致染色体数目不完整；培养液的pH值应掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸发育不良，偏碱时细胞出现轻度固缩。 9．玻璃器皿都要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯为好。 10．操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染；在外周血培养中，PHA对淋巴细胞的作用，个体差异较大。同样方法和条件，分裂相多少及分散情况不一样。因此，若首次失败，应充分考虑到这些因素。 （五）预期实验结果及分析 将制作好的片子在油镜下仔细观察，选择较好的分裂相进行照相、剪贴、分组，将照片上的核型进行剪贴，写出实验报告与实验结果。 染色体数目为46XX，（XY）为人类正常核型。若某对染色体少了一条（2n-1），细胞染色体数目为45；或某一对染色体多了一条（2n+1），细胞染色体数目为47；若为两种核型，46，XX/46，XXY称为嵌合体。以上三种为异常核型。 （吴白燕） 实验3-2、染色体显带技术 一、实验目的 了解G显带标本的制作过程；并通过G显带核型分析，初步掌握各号染色体G带的带型特征。 二、实验原理 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本