RA树突状细胞泛素和E3连接酶定量PCR检测体系的建立及青藤碱的干预作用.pdfVIP

理论广角 I■ RA树突状细胞泛素和E3连接酶定量PCR检测体系的建 立及青藤碱的干预作用① 庞 捷 余克强 (1．中山市中医院肾内风湿科 广东 中山 528400：2．南方医科大学科技处 广东 广州 510515) [摘 要】目的：建立类风湿关节炎(RA)患者树突状细胞(DCs)泛素和E3连接酶荧光定量PCR检测体系，观察青藤碱对RA患者DCs泛素和E3连接酶mRNA 表达的影响。方法：体外分离RA患者单核细胞 ，采用细胞因子刺激为DCS。提取DCS总RNA，采用特异性荧光探针标记后进行PCR反应，建立荧光定量 标准曲线。采用不 同浓度青藤碱干预DCs，荧光定量PCR检测干预后泛素和E3连接酶 mRNA的表达。结果：不同浓度定量模板的对数值与循环数之间有 非常好的相关关系，经青藤碱干预后RA患者外周血Dc中泛素(P0．01)和E3连接酶 (PO．0I)mRNA表达显著降低。结论：研究成功的建立了RA患者DCS泛 素和E3连接酶荧光定量PCR检测体系，青藤碱可能抑制 了泛素一蛋白酶体的功能，降低了NF—KB途径的磷酸化 ，影响了Des的免疫功能，从而起到治疗 RA的作用。 [关键词]类风湿关节炎 树突状细胞 青藤碱 泛素和E3连接酶 中图分类号 ：R593．22 文献标识码：A 文章编号 ：1009—914X(2olo)34—0210—02 类风湿关节炎 (rheumatoidarthritiS，RA)是一种以关节滑膜炎为特 藤碱对DCs中泛素、E3连接酶mRNA表达的影响。 征的慢性全身性 自身免疫性疾病 。滑膜炎持久反复发作，可导致关节 内软 1材料与方法 骨和骨的破坏…l。树突状细胞(dendritiCcel1S，DCs)是作为免疫反应和 11主要仪器设备和试剂 免疫耐受的中心调控，在RA的发病中起着重要的作用 泛素一蛋白酶系 Taq酶 (美国ABI公司)，DNA纯化试剂盒 (0IAGEN公司)，标准分子量蛋 统介导的蛋白降解是细胞 内蛋白经非溶酶体降解的主要途径 ，它通过调节 白(美国InvitrOgen公司)，引物、荧光探针合成(广州达安基因公司)， NF—KB途径的磷酸化参与Dc免疫功能的调节和免疫反应 一。本研究拟建立 水平电泳仪(美国Bio—rad公司)，逆转录酶 (Promega公司)，青藤碱干粉 RA患者DCs泛素和E3连接酶荧光定量PCR检测体系，并采用该体系观察青 (湖南正清药业有限公司)，PE 7000全 自动荧光定量PCR仪 (美国Perkin Eimer公司)。 表 i泛素、E3连接酶引物序列和扩增产物长度 1．2患者资料 南方医科大学南方医院风湿科 门诊活动期RA患者8名，其中男性2名， eDNA pmwrs tqu。ne{s p t 一罅， productssi Wl~quitkt M 0啪 19)s∞s‘ 表2青藤碱对RA患者外周血Dc中泛素、E3mRNA~ ( ±S，n=1o) anti-s~nsc AC觚 CCTGAACCTaaCC^T Group UbiquitinmRNA f(oldincrease) E3mRNA(foldincrease) probe FA TOCGTaoCTCCC盯 G-T^ A m (t~ m(ay5) scn$~ ATaCCAGCA0oAOTOAooATGT 74 control I．O士O1 1．O走O．