5-Aza-2dc通过表观修饰对Naive T细胞诱导的研究.pdfVIP

HEIL0NGJIANG MED1CINEANDPHARMACYJun．2011，VoI．34No．3 ·31 · 5一Aza一2dc通过表观修饰对NaiveT细胞诱导的研究 何 敏 ，卢思广 (1．徐州医学院．江苏 徐州 221002；2．徐州医学院附属连云港第一人民医院儿科 ，江苏连云港 222o0o) 关键 词 ：5一Aza一2dc；Treg细胞 ；DNA 甲基化 中图分类号：Q786 文献标识码 ：B 文章编号：1008—0104(20l1)03—0031—01 30多年前 ，研究者发现 了大量具有解除特异抗原的免疫 CD25一T细胞 ，阳选 CD4。。CD25Treg细胞 (即nTreg)。分别 应答的淋巴细胞。在1975年，这些细胞被命名为抑制细胞，即 取少量分选所得细胞，加入抗 CD4／抗 CD25荧光抗体，避光 目前的Treg细胞 ，它可抑制器官移植 的排斥反应l】]。Treg细 孵育15rain，PBS缓冲液洗涤一次，加 PBS重悬，然后上流式 胞表面高表达 CD25，而胞 内Foxp3基因是其一个相对特异 细胞仪 (FCM)检测纯度。 标志和功能分子 。高表达Foxp3基 因的Treg细胞对于维持免 1．2．3 分选细胞活性及计数检测 疫系统的内环境 的稳定和预防 自身免疫疾病有极其重要的 利用台盼蓝染色法评价淋巴细胞活性，取0．1mL细胞悬 作用[。而 Foxp3基因的稳定表达可通过表观修饰方式调节 ， 液，加等量 的0．4 台盼蓝溶液 ，充分混匀，染色2min。取上述 如组蛋 白及 DNA修饰 。在 Treg细胞 中，foxp3启动子 区的 细胞悬液少许滴在盖玻片上或下侧 的计数板凹足l曹处流出悬 CPG模体几乎完全去 甲基化 ，显示稳定的Foxp3的表达 ，而 液 ，至盖玻片被液体充满为止 。置显微镜下计数 四角大方格 CD4CD25T细胞正好相反_3“]。目前 ，5一杂氮一2一脱氧 内的细胞总数 。计数其 中蓝染的细胞 。结果显示正常细胞不 胞苷 (5一Aza一2dc)是研究最多的去 甲基化药物 ，它能够逆 着色，死细胞被染成蓝色 。细胞活力及密度按下列公式计算 ： 转基因的甲基化状态 ，从而恢复基 因的表达水平 。近年来 ，国 细胞活力 ( )一 (总细胞数一着色细胞数)÷总细胞数 × 内外对组蛋 白去乙酰化抑制酶试剂 (如 TSA)通过表观修饰 1()(1 ；细胞密度一(4个大格细胞总数 ／4)×1O／mL 研究较多，但使用 DNA 甲基化酶抑制剂5一Aza一2dc诱导 1．2．4 制备抗原提呈细胞 Treg细胞研究较少 ，特别是这种药物对 Treg细胞表型维持 的研究。本研究中．用5一Aza一2dc试剂使 DNA去 甲基化 ， 使用含 10 胎牛血清 的RPMI1640细胞培养液调整部 分 CD4 CD25一T 细胞 密度 至 1×10／mL，加入 终浓 度 促进特异基 因Foxp3的表达 ，并可使 CD4CD25T细胞转 化为 CD4CD25T细胞 ，从而为稳定与预防 自身免疫疾病 25~g／mL的丝裂霉素 C，置37C，5 CO2条件下培养30min， 提供新 的思路与方法 。