Tumstatin-EGFP在CHO细胞中的表达和活性分析.pdfVIP

安徽 医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2008Dec；43(6) ·603 · Tumstatin-EGFP在 CHO细胞中的表达和活性分析 姚丽娟，罗以勤，孔建新 ，赵 亮，濮跃晨，马筱玲 摘要 目的 分析融合蛋 白tumstatin．EGFP在中国仓鼠卵 期长等等亟待解决的问题，因此，需要更好的解决方 巢细胞 (CHO)中的表达及生物学活性。方法 经过酶切和 案提高 tumstatin的抗肿瘤效应。在所有提出的改 测序正确 的真核表达载体 PIRESneo3／STL—EGFP、PIRES— 进方法中以多种血管生成抑制因子或血管生成抑制 neo3／sig—EGFP和空载体稳定转染 CHO细胞后 ，用 Western 因子一抗肿瘤细胞药物的联合应用 I5为现今主导 blot从细胞上清液中检测融合蛋 白的表达、倒置荧光显微镜 治疗肿瘤的方向之一。在本实验中，我们利用增强 观察绿色荧光蛋白的表达。通过生长曲线分析外源基 因的 型绿色荧光蛋 白(EGFP)为荧光报告分子且较少与 导入对CHO细胞生长的影响，MTr法和管状形成抑制试验 其相融合的基因相互作用，方便地在细胞内观察到 评估tumstatin．EGFP融合蛋白的tumstatin样活性 ，体外靶向 报告基因和 目的基因的表达产物的特性，用基因重 试验验证tumstatin能否携带融合蛋白特异性结合内皮细胞。 组技术将全长 tumstatin基因与 EGFP融合构建的 结果 获得了稳定转染的CHO细胞系。生长曲线表明转染 后的较未转染的CHO细胞生长缓慢，MTI试验和管状形成 tumstatin—EGFP分泌型真核表达载体稳定转染 CHO 抑制试验分别证实了融合蛋 白tumstatin—EGFP具有抑制 内 细胞后，分析表达的融合蛋白是否保持各 自的生物 皮细胞增殖 ，明显抑制血管管状结构的形成 的作用；体外靶 学活性以及在倒置荧光显微镜下检测 tumstatin是 向试验也验证了tumstatin-EGFP能够特异性结合内皮细胞。 否在融合 EGFP后仍具有特异性靶向血管内皮细胞 结论 重组真核表达载体在 CHO细胞获得稳定表达，融合 的功能，为探讨tumstatin的作用机制及其融合蛋 白 蛋 白tumstatin-EGFP的表达不影响tumstatin和EGFP各 自的 的深入研究奠定基础。 生物学活性，并且在体外tumstafin能特异性携带 EGFP靶向 内皮细胞，为进一步 tumstatin及其融合蛋白的研究奠定基 1 材料与方法 础。 1．1 材料 主题词 绿色荧光蛋白质类 1．1．1 质粒、菌株和细胞 测序正确的表达载体 自由词 肿瘤抑素；融合蛋白 PIRESneo3／STL—EGFP，PIRESneo3／sig—EGFP(包 括 中图分类号 R341；R394 质粒 pIRESneo3、PEGFP—C2、pGEM—T／STL、pGEM—T／ 文献标识码 A 文章编号 1000—1492(2008)06—0603—05 STL—EGFP，信号肽，tumstatin和连接臂片段)，菌株 DH5a，CHO细胞，人脐静脉内皮细胞 ECV340细 肿瘤抑素 (tumstatin)是属于靶向肿瘤新生血