转录因子t-bet在人CD8^＋T细胞和γδT细胞干扰素-γ产生中的作用.pdfVIP

4l80 实用医学杂志2008年第 24卷第 24期 转录因子 t-bet在人 CD8+T细胞和 ^yT细胞 干扰素一 产生中的作用 汪洪涛 薛祝平 李柏青 摘 要 目的：探讨转录因子t_het对人CD8T细胞和 ly8T细胞干扰素一 (IFN )产生的调控作用。方法：化 学合成针对人t-bet基因的小干扰RNA(siRNA)，转染体外培养的人 ^y8T细胞和dpT细胞，利用流式细胞仪分选 纯化 CD8+T细胞和8 T细胞，半定量RT．PCR检澳lCD8T细胞和 8T细胞中t-betmRNA的表达变化，流式细 胞术检测转染前后 IFN．产生的变化情况。结果：转染 siRNA后的人CD8T细胞和 8T细胞 t．hetmRNA表达强 度分别为(24．75±1．18)％和(25．28±1．04)％，较转染前明显减小(P0．05)；在 t-het表达受到抑制的同时，8T 细胞中IFN +细胞为 (56．57±6．67)％，与错义序列组比较差异有显著性 (P0．05)。结论 ：siRNA可有效降低人 CD8+T细胞和^y6T细胞t-bet的基因表达，转录因子t_het在 8T细胞 IFN一产生中所起的作用与CD8T细胞不 完全相 同。 关键词 干扰素 Ⅱ型 t．bet siRNA 免疫效应细胞可以通过细胞免疫应答清除病毒 业公司产品。抗人 CD3单克隆抗体 (CD3mAbOKT3)， 和胞内感染细菌。这些免疫效应细胞主要有Thl型 由原美 国宾夕法尼亚大学医学院微生物系Carding教 CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞。它们的共同特 授惠赠。培养基 OPTIMEM~ I为GIBCO公司产品。 点是都可产生细胞因子干扰素一 (IFN．^y)。 T细胞 抗人 CD3．APC为 CALTAG产品，抗人 CD8．PE为天 是近 20余年来逐渐认识的一种特殊的T淋巴细胞亚 津协科产品，抗人TCR3,8．PE为BD公司产品，抗人 群，活化后可优势产生 IFN．^y，具有与CD8T细胞相 IFN一8．FITC购 自Ancell公司 。脂质体 DMRIE．C 似 的功能，在抗感染免疫、抗肿瘤免疫 中发挥重要作 Reagent为 Invitrogen公司产品。PCR试剂 ：细胞总 用 。t-bet(T—boxexpressedinTcel1)是 2000年哈佛大 RNA提取Trizol试剂盒 ，Promega公司产品；RT—PCR 学 Glimcher研究小组分离出的一种新的在 CD4Thl 试剂盒，上海生工生物工程公司。针对人 t-bet基因序 型细胞的分化中起重要作用的属于 t-box家族的转录 列特异性小干扰 RNA(siRNA)由上海吉玛制药公司 因子[，曾被认为是调控编码免疫效应分子 IFN．^y基 合成。PCR引物均 由上海生工生物工程公司合成。 因表达的主要调控者，但近来研究者发现这类调控机 1．2 激活和扩增外周血 T细胞和 0B【T细胞 抽 制并不适用于所有T细胞 ]。本实验我们利用流式 取健康成年人志愿者外周静脉血，肝素抗凝 ，常规密 细胞仪分选纯化 CD8+T细胞和6T细胞，运用RNA 度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞 ．培养液调 干扰技术，干扰转录因子 t-bet的表达 ，流式细胞仪检 整细胞浓度为(1～2)×106／mL，植入 24孔细胞培养 测分析细胞因子产生的变化 ，比较分析沉默 t-bet基 板中，每孔 lmL。加入结核杆菌低分子量多肽抗原 因对于人活化的CD8T细胞和 8T细胞 IFN．1，产生 (Mtb．Ag，终浓度 5~g／mL)和 rhIL一2(终浓度 5OU／ 的影响．探讨转录因子 t-bet对人 CD8+T和 ^y8T细胞 mL)，用于诱导和扩增结核杆菌抗原激活的T细胞 IFN．^y产生的调控作用。