艾美耳球虫单卵囊分离及PCR鉴定.pdfVIP

中国兽 医杂志 2OO8年(第 44卷)第 12期 25 艾美耳球虫单卵囊分离及 PCR鉴定 高 英 ，郭 莉 ，赵 月兰 ，包永 占 ，秦建华 (1．河北农业大学动物科技学院，河北 保定 O71O](1；2．河北农业大学中兽医学院，河北 定州 O73OO0) 中图分类号 ：S852．72 3 文献标识码 ：B 文章编号 ：O5296OO5(2OO8)12一OO25一O2 目前为止，鸡主要有 7种艾美耳球虫 ，在卵囊形 囊均弃之不用 ，完成单卵囊的接种 。接种 的雏鸡 自 态 、结构 、大小、肠道病变、寄生部位 、最短孢子化时 60h开始 ，每 2d检测 1次粪便 ，以确定是否感染。 间、最短潜伏期等方面均具有 自身特征u]。这使球 对感染的雏鸡 ，用饱和盐水漂浮法收集粪便 中的卵 虫诊断问题复杂化。近年来 ，分子生物学和基因诊 囊，经完全孢子化后 ，于 2．5％(w ／V)重铬酸钾液中 断学在理论和技术上 的发展，为虫种鉴定和病原学 4℃保存备用 。 诊断提供 了有用的工具 ]，本试验利用单卵囊分离 1．4 纯种增殖 单卵囊繁殖的后代卵囊孢子化后， 技术得到艾美耳球虫纯种卵囊 4株 ，常规鉴定为堆 再接种无球虫感染的雏鸡 ，进行卵囊增殖 。 型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫 。经增殖纯化后， 1．5 虫种常规鉴定 纯种卵囊增殖后 ，以每只鸡 提取其基因组 DNA，用特异性 引物进行 PCR扩增 1O万个孢子化卵囊分别经 口感染 2周龄无球虫感 进一步证实该虫种是否为纯种 ，为进一步研究堆型 染雏鸡 30只 ，按鸡的I临床症状 、潜伏期 、最短孢子化 艾美耳球虫建立其噬菌体抗体库奠定坚实的基础 。 时间以及卵囊的形状指数 、结构等一系列指标，参考 1 材料与方法 国内外文献_】_8]，确定其种。 1．1 实验动物 购于保定大午有 限公司 1日龄雏 1．6 球虫卵囊的纯化 用清水洗去收集的孢子化 鸡 ，在无球虫环境下笼养至 l5 日龄用于试验。试验 卵囊溶液 中的重铬酸钾，依次用 2O0目、3OO目和 虫种 ，取 自保定市某鸡场死于球虫病的鸡肠道 内容 4O0目铜筛过滤，滤液经 3OOOr／min离心 15min， 物中，按常规方法分离出球虫卵囊 ，培养至孢子化 ， 去掉上清液 ，在沉淀中加入饱和盐水 15OOr／min离 为混合 卵囊。 心 1Omin，离心管上层飘浮的乳 白色似 “塞子”状 的 1．2 基 因组 DNA提取试剂盒 购于天根生化科 物质即卵囊 。将其移入新管中，用 10倍的蒸馏 技 (北京)有 限公 司，DL一2OOO，DL一3OO0购于保定 水稀释 ，3000r／min离心 15min收集沉淀 ，然后于 市海赛克生物技术有限公司，PCR试剂为宝生物工 沉淀中加入 20 次氯酸钠，在 4℃下作用 2Omin，最 程 (大连)有限公司产品。 后用灭菌的蒸馏水离心洗涤 3次 ，除去小的杂质和 1．3 单卵囊分离病料中的球虫卵囊 取分离的混 次氯酸钠 ，即可得到纯化的孢子化卵囊。 合卵囊 ，加适量 自来水离心 (3oOOr／min离 心 1O 1．7球虫卵囊基因组 DNA的制备 将纯化好的卵 min)。弃掉上清后再加 自来水进行第 2次离心 ，反 囊 3O0Or／min离心 1Omin，弃掉大部分上清后，用 复 3次直至上液澄清。在试管中将离心的卵囊液用 超声波细胞粉碎仪对球虫卵囊进行裂解 (150w，8 生理盐水进行倍 比稀释 ，并不断在显微镜下观察 ，使