绵羊重组朊蛋白特异性抗体的制备.pdfVIP

中国兽医杂志 2OO8年 (第 44卷)第 12期 23 绵 羊 重 组 朊 蛋 白特 异 性 抗 体 的 制 备 余 琦 ，周向梅 ，李丽好 ，任 伟 ，赵德 明 (1．中国农业大学动物医学院 国家动物海绵状脑病实验室，北京 海淀 1OO193； 2．北京市畜牧兽医总站 ，北京 朝 阳 1。O1O7) 中图分类号：S857．659．7 ．文献标识码 ：B 文章编号：O529—6OO5(2Oo8)12一OO23一O2 传染性海绵状脑病 (transmissib1espong．form 1．2 免疫原准备 绵羊复性重组朊蛋 白由国家动 encephalopathy，TSE)是一类累及人和动物 的中枢 物海绵状脑病实验室刘美丽给予。 神经系统的退行性、致死性疾病 ]，其病因目前认为 1．3 动物免疫 Balb／c小 鼠12只，分 3组 ，每组 4 是神经细胞表面的一种正常朊蛋 白PrP 构象发生 只，采用不同的免疫途径加 以免疫 (表 1)。 改变形成异常朊蛋白PrP 所致。人类 TSE包括克 表 l Balb／c小 鼠免疫方案(免疫剂量 ：1O0 g／只) 雅氏病 (CJD)和新型克雅 氏病 (vCJD)、Kuru病等。 动物 TsE主要有牛海绵样脑病 (BSE)、羊瘙痒病 等。目前该病的诊断主要依赖免疫学诊断技术来检 测神经组织 中的 PrP ，如 PrP的免疫组织化学 (IHC)¨2]、免疫转印技术 (wB)_3]和酶联免疫吸附测 定 (EUSA)_l4]，抗 PrP特异性抗体 已经成为绝大多 1．4 间接 EuSA检测小鼠血清效价 分别在二免 和三免后 1Od小 鼠尾部采血 ，收集血清。建立 间接 数 PrP 免疫学检测 的重要试剂，也是研究 PrPC生 ELIsA检测小 鼠血清效价 的方法。绵羊复性重组 理功能和特点的有力工具 。制备特异性、灵敏度高 朊蛋白包被酶标微孔板 ，4℃过夜 。明胶封 闭37℃ 的PrP抗体 ，并在此基础上建立准确 、灵敏、简便 、 3Omin。加入待检小鼠血清，37℃ 1h。加入辣根过 快速检测 PrP的方法，一直是研究 TSE的热点 。 氧化物酶标记的羊抗 鼠IgG，37℃ 1h。加入底物溶 1 材料与方法 液 (TMB)，37℃ 15min。加入 终止液后，450nm 1．1 材料 6周龄清洁级雌性 Ba1b／c小 鼠、弗 氏 波长测量 OD值。以P／N ≥2．1为抗体反应阳性 完全佐剂、弗氏不完全佐剂 、辣根过氧化物酶标记羊 的判定标准 。 抗 鼠IgG、增强型 HRP—DAB底物显色试剂盒等。 1．5 Western_b1ot鉴定抗体特异性 建立 West— ern_blot方法 [，采用 BioRad微型垂直板 电泳转 印 收稿 日期 ：2OO7一O7—19 系统，样品于 l5 SDS电泳分离。电泳后， 基金项 目：国家科技支撑计划 (2。o6BAD06A13) 4℃，6OV转印2．5h，将蛋 白转移到硝酸纤维