棉铃虫Bt抗性DNA分子检测引物的设计与筛选.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 --——103--—— 棉铃虫 抗性 DNA分子检测引物的设计与筛选 魏秋学，石仕福，苏建亚，沈晋 良 (南京农业大学植物保护学院农药系，江苏南京210095) 摘要：通过比对分析GenBank中已登录的棉铃虫 (HelicoverpaarrnigeraHtibner)钙黏素基因序列，选择其中保守的外显子序列区 域，设计多套DNA扩增引物，利用这些引物检测室内棉铃虫品系和 田间棉铃虫对 转基因棉的抗性，最终筛选出1套可以直接检测田 问棉铃虫因钙黏素基因突变引起的 抗性DNA分子检测引物。 关键词：棉铃虫；Bt；抗性 ；DNA分子检测；引物；筛选 中图分类号：$435．622 ．9 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2008)06-0103-05 棉铃虫 (HelicoverpaarmigeraHtibner)是世界范围内严重 过DNA分子检测进行引物筛选，以建立一种可用于检测田间 影响棉花生产的一种害虫。在中国，自1997年以来 ，种植 棉铃虫因钙黏素基因突变引起的对成转基因棉产生抗性的 转基因棉已成为防治棉铃虫的重要手段…。连续多年大面 DNA分子检测方法。 积种植成转基因棉 ，棉铃虫对 转基因棉产生抗性的现象 1 材料与方法 及其发展趋势已经引起有关专家的重视。 已有许多研究表明多种害虫已经对 转基因棉产生抗 1．1．供试棉铃 虫品系 性 ，所报道的这些害虫的抗性品系大部分是由室内筛选 棉铃虫敏感品系SUS2，为 1991年采 自河南省偃师市棉 出来的，有关 田间害虫对 产生抗性的报道只有小菜蛾 。 田的第二代棉铃虫，在室内不接触任何农药 ，经人工饲料饲养 孟凤霞等用 转基因棉筛选棉铃虫的幼虫，得到了对 转 120代，供测试；棉铃虫抗性品系YCR，是品系SUS2室内人工 基因棉具有高水平抗性的棉铃虫品系，并证明这种抗性是 由 饲料饲养53代后的群体 ，在室内用转 基因棉叶连续筛选 单染色体不完全隐性等位基因控制的 。 50多代，对Bt原毒素CrylAe和2l％MVPII可湿性粉剂的抗 传统的生物测定方法早已应用于检测害虫对转 基因 性达 1600倍以上，其抗性表现为单个主效基因的不完全隐 棉的抗性 。但是传统的生物测定方法有一定制约性，包 性遗传 。试虫采用人工饲料饲养，饲养条件为温度 (274- 括无法区分杂合子(sr)和敏感纯合子 (SS)，检测采样量大，需 1) ，相对湿度6o％一80％，光、暗周期 14h：10h；棉铃虫 饲养昆虫，并费时费力等 】。DNA分子检测技术与传统的 抗性杂合品系为SUS2与YCR交配的子代。 生物检测技术相比，有以下几大优点：(1)不管是显性特征还 1．2 棉铃虫DNA的提取 是隐性特征，DNA分子检测技术都可以区分个体是杂合子 利用Reineke等 ”方法稍加改进，提取用于PCR扩增反 (fir)还是敏感纯合子 (ss)；(2)DNA分子检测技术是直接检 应模板的棉铃虫基因组 DNA。 测基因的差异，而不是仅仅依赖于观察表型的差异；(3)DNA 1．3 钙黏素基因序列比对 分子检测技术在害虫的各个生长发育期都可以应用，甚至是 以Helicoverpaarmigeraeadherin为关键词，在GenBank中 死虫也可以用作样品；(4)在抗性纯合子数量稀少的情况下， 搜索棉铃虫钙黏素基因序列，用 BioEdit软件对搜索到的棉铃 DNA分子检测技术 比传统的生物检测方法更有效、更 虫钙黏素基因序列进行分析。 灵敏 。 1．4 引物设计 应用DNA分子检测技术必须事先知道田间害虫对Bt毒 根据GenBank中已登录的棉铃虫的钙黏素基因序列，尽 素的抗性机制，已有