沙门氏菌X4062染色体-质粒平衡致死系统的构建毕业论文.doc

本 科 毕 业 论 文 沙门氏菌X4062染色体-质粒平衡致死系统的构建  原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 摘 要 鉴于临床多种耐药性菌株不断产生和迅速水平传播扩散，FDA ( Food and Drμg Administration食品与药物管理机构)已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。染色体-质粒平衡致死系统是近年来发展起来的一类以非抗生素作为筛选标记的载体表达系统，它的宿主菌通常是一类染色体管家基因的突变体，该缺陷型菌株不能在基本培养基上生长，当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式构成染色体-质粒平衡致死系统，此时互补质粒对其宿主菌的生长起到功能性互补的作用，一旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡。 基于减毒沙门氏菌染色体上asd基因的已知序列，利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建沙门氏菌X4062的asd基因缺失突变株X4062 △asd::cat，在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶基因的质粒pCP20介导二次同源重组，以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果，证明沙门氏菌X4062Δasd缺失突变株的正确构建。另外，从沙门氏菌X4062基因组中扩增出asd基因片段，将该片段整合到带有表达荧光蛋白基因的质粒pEGFP中，命名为pMD-asd。缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力，只有添加DAP或导入含有asd基因的质粒（pMD-asd）才能在LB培养基上生长，与原型沙门氏菌X4062比较，其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致，基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统。 关键词：FDA 沙门氏菌 受体菌 Red重组系统 asd基因 缩略语及英汉对照 Amp ampicilin 氨苄青霉素 Cm chloroamphenicol 氯霉素 Food and Drμg Administration 食品和药物管理局 DAP diaminopimelic acid 二氨基庚二酸 aspartate semialdehyde dehydrogenase asd基因 ddH2O double distilled water 双蒸水 dNTPs deoxyribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷 Luria-Bertani 细菌基础培养基 h hour 小时 min minutes 分钟 mL milliliter 毫升 mmol millimolar 毫摩尔 mol molar 摩尔 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 rpm round per minute 每分钟转数 s seconds 秒 RNA ribonucleic acid 核糖核酸