PCR检测病毒核酸在血制品生产中的应用.pdfVIP

维普资讯 中国输血杂志2004年 12月第 17卷第 6期 ChinJBloodTransfusion，December，2004，Vo1．17，No．6 ● 实 验 研 究 ● PCR检测病毒核酸在血制品生产中的应用 刘伟雄 王 坚 宋正敏(上海莱士血制品有限公司．上海 200245) 摘要：目的 建立适用于血制品企业的PCR检测原料血浆的方法。方法 以HBV，HCV和 HIVPCR荧光定 量检测试剂和WHO标准 品对CAP样 品、BBI样 品和公司混合血浆进行测定，追踪调查部分阳性血浆献浆者。结果 PCR检测结果与CAP和BBI公布结果基本相符。在原料血浆中用 PCR方法检 出35份 阳性血浆。结论 PCR 检测技术能应用于血制品企业。 关键词：基 因扩增技术 PCR 混合血浆 中图分类号：R392．33 Q52 文献标识码 ：A 文章编号：1004—549X(2004)06—415—03 为保证输注血制品的安全性，原料血浆必须经过严格的 1．3．2 提取试剂准备 按试剂盒说明书，配制洗涤缓冲液 病毒筛查，在血制品生产中要使用有效的去除／灭活病毒工 工作液、结合缓冲液工作液和除抑制物缓冲液工作液。 艺 。目前 国内血制品企业普遍采用 ELISA方法检测原料血 l_3．3 样品提取 每个 2．0ml离心管加人 1680~1待检 的 浆。但在窗口期内，已受病毒感染的献血者体内还没有足够 混合血浆．用超高速离心方法浓缩病毒颗粒。保留离心管下 数量的抗体，ELISA方法检测结果为阴性。这是输血或输 部约 120~1液体及沉淀用于病毒核酸提取。各加人 50z／l蛋 血制品导致病毒感染的主要原因。Schreiber等研究表明． 白酶K和 200,ul结合缓冲液工作液。72℃水浴 15min。加 使用高度灵敏的PCR方法检测 HCV、HBV和 HIV，窗口期 人 125~1异丙醇，转人加套管的提取柱，8000g离心 irain。 可分别缩短至 59d，29d和 1ldC。为了更好地保障血制 品 加人 500~1除抑制物缓冲液工作液于 8000g离心 irain。加 的安全 ，上海莱士血制 品有限公司 已于 2001年正式采用 人450~1洗涤缓冲液工作液于8000g离心 irain。再次用 PCR检测技术对每批原料血浆进行 HBV·DNA。HCVR·NA 450~1洗涤缓冲液工作液洗涤后 ，首先 8000g离心 irain，然 和HIV—RNA检测。ELISA和PCR检测都为阴性的血浆才 后 13000g离心 10s。换上 1．5ml离心管，加人 50z／l洗脱缓 能投产。规模生产的去冷胶血浆和公司成品每批也进行 了 冲液于8000g离心 imin，收集滤出液。 PCR检测。 1．3．4 检测试剂 HBV检测每个反应体系配制 ：HBV PCR反应液 37．6l、Taq酶0．4l、UNG0．O6l。HCV检测 1 材料与方法 每个反应体系配制：HCVRT-PCR反应液 34．1l、Taq酶 1．1 试剂 核酸提取纯化试剂盒(Roche公司)；PCR反应 0．5l、PCREnhancer0．4l。HIV检测试剂每个反应体系 试剂盒 (深圳匹基生物技术发展有限公司)；无水乙醇(分析 配制：HIVRT-PCR反应液 34．1l、Taq酶 0．5l、PCREn- 纯 。上海化学试剂有限公司)、异丙醇 (分析纯。上海试剂一 hancer0．4 l。 厂)；WHOHBVDNA标准品(NIBSCCode97／746)、WHO l_3．5 加样和检