C反应蛋白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响.pdfVIP

第 2O卷第 1期 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 VoI．2O．No．1 2011年 2月 CHINESE J0URNAL0FHIST0CHEM ISTRY AND CYToCHEM ISTRY Feb．2011 C反应蛋 白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠 血管平滑肌细胞 TNF一0t表达的影响 李茂荣 刘正湘 (北京航天总医院心血管 内科 ，北京 100076； 。华 中科技大学 同济医学院附属 同济医院心血管内科 ，武汉 430030) [摘要] 目的 构建小鼠c_反应蛋 白基 因重组质粒 pIRES-CRP，观测其对血管平滑肌细胞 TNF_a表达 的影响。方法 用 RT-PCR法 ，以小 鼠肝组织 RNA为模板 ，扩增获得编码 C一反应蛋 白(C—reactiveprotein，CRP)的全长基 因。将 CRP基 因克 隆人真核表达质粒 plRES中，构建重组真核表达质粒 plRESCRP。将重组质粒转染 HeLa细胞 ，通过 RT—PCR法检测 CRPmRNA的表达 ，Westernblot检测 CRP蛋 白的表达 。将 阳性质粒转染小 鼠血管平滑肌细胞 ，通过 Westernblot检测 CRP 对 TNF—ct表达 的影响。结果 经酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明，所克隆的CRP基 因与报道结果完全一致 ，重组体 的连 接方向正确 ，阅读框与预期完全一致 ，真核表达质粒 plRES-CRP构建成功 。将重组质粒 pIRES-CRP瞬时转染 Hela细胞 ，通 过 RT—PCR和Westernblot证实 CRP基 因得到表达 。将 阳性质粒转染小 鼠血管平滑肌细胞 ，TNF_a的表达明显高于空 白对 照组和空载体组 (PO．O1)。结论 成功构建小 鼠CRP基 因重组质粒 plRES-CRP，CRP基 因能在人子宫颈癌 Hela细胞 中正 常转录和翻译 ，表达的蛋 白能与 CRP的特异抗体反应 。CRP能明显上调小 鼠血管平滑肌细胞 TNF-a的表达 ，这为解释 CRP 在冠状动脉 的形成过程 中起着促炎作用提供 了新 的实验依据 。 [关键词] 小 鼠肝细胞 ； 小 鼠血管平滑肌细胞 ； C一反应蛋 白； TNF-n； 基因表达 (中图分类 号] R329 [文献标识码] A D0I：10．3870／zgzzhx．2011．01．003 ConstructionandexprerssionofmouseC-reactiveproteineukaraoticplasm idanditseffecton TNF-aexpression inmouseaorticsmoothmusclecells LiM aorong LiuZhengxiang。 (DepartmentofCardiology，BeijingAerospaceGeneralHospital，Beijing100076； DepartmentofCardiology，TongJiHospital，TongjiMedicalCollege，Huazhong UniversityofScienceandTechnology，V “han430030，China) [Abstract] 0bjectiveToobtainthefulllengthgeneofC—reactiveprotein (CRP)from mouseliver cells，toconstructtherecombination plasmidpIRES—CRP andtoinvestigateitseffecton TNF—aExpres— sion inmouseaorticsmoothmusclecells．MethodsCRP geneswereobtainedbvRT—PCR withtotalRNA ofmouseasthetemplateandclonedintotheeukaryoticexpressionplasmidpIRES toconstructtherecom—