国境口岸冠状病毒（NL63与HKU1）实时荧光RT-PCR检测方法-编制说明.docVIP

出入境检验检疫行业标准草案编制说明 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 英文 Detection Method for Human coronavirus NL63 and human coronavirus HKU1by real time fluorescence RT-PCR at frontier ports 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 □等同 □修改 □非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 计划编号 2012B4 1.4 制（修）订情况 (制□修订 替代的标准编号 1.5 起止时间 年月--- 年月 1.6 项目承担单位 1.7 起草团队 1.8 专业类别 □食品（化妆品）检验；(卫生检疫；□动物检疫；□植物检疫； □纺织产品检验；□轻工产品检验；□机电产品检验；□化工、矿产品和金属材料检验；□管理；□鉴定；□包装及危险化学品 1.9 标准体系表代码 1.10 调整情况 2.1 目的、意义 2.2 与国内外相关标准、文献的关系 3 编制过程 3.1 准备阶段（可选项） 3.2 分工情况 3.3 标准草案编写情况 3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 3.5 审定情况 （适用于报批稿） 3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）  4 主要技术内容的确定 人冠状病毒NL63 实时荧光PCR检测方法 1、 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 HCoV-NL63质粒：根据提供的DNA 序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR 方法，把单链小片段DNA 拼接成一条完整的双链DNA片段。DNA合成由大连宝生物有限公司完成。将合成的HCoV-NL63 DNA连接、转化至E.coli Competent Cell JM109载体上，构建质粒，用于实时荧光PCR的模板。病毒基因的合成和质粒的构建由大连宝生物有限公司完成。 1.1.2 阳性标本 人甲型流感病毒、2009甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性咽拭子标本均为本实验室测序确证样本、H5N1和H9N2核酸为北京疾病预防控制中心和中国军事医学科学院提供。肠道病毒CA16和EV71标本为四川国际旅行卫生保健中心提供。 1.1.3 阴性标本 采集的94份正常人咽拭子来自深圳口岸医院正常人群。 1.1.4 实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司ABI 7500型。核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司Viral RNA Mini Kit。Real-time PCR试剂盒为日本Takara公司产品。引物和探针由上海生工有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 引物和探针的设计 从NCBI-Genebank 获取HCoV-NL63 的基因序列 利用软件 Bioedit 5.0 对各型基因组序列进行比对找出一段高度保守区用Primer Express3. 0和Primer 5设计引物和探针，并且对所设计的引物探针进行NCBI-BLAST检索，其结果为100%与HCoV-NL63同源理论上排除了其他微生物或人类基因组扩增的可能性。Taq-man MGB探针修饰 5'-HEX，3'-NEG，PCR 产物的大小为81bp。 表1 HCoV-NL63 real time RT-PCR引物和探针的名称、序列和碱基的位置 引物和探针 位置* 序列（5’to3’） 备注 正向引物NL63-FP 26706-26729 GGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCA 扩增片段大小为bp 反向引物NL63-RP 26762-26786 GGGTTGAGAAAGAGGCTTATTAGGT 探针NL63-Probe 26731-26750 CTAGTTCTTCTGGTACTTCC 1.2.2 病毒RNA的提取 采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒，将560μ1准备好的含有Carrier RNA的AVL缓冲液加入1.5ml离心管；取咽拭子浸泡液140微升AVL／Carrier RNA缓冲液的离心管，震荡混匀15秒；室温(15-25℃)孵育10分钟；将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；加入560μl乙醇(96-100％)，震荡混匀15秒；震荡混匀后，将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；将630μl上一步骤中的溶液小心转入QIAamp RNA 提取柱（放置于2ml收集管里），注意不要碰湿柱子边缘。盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟。将柱子移入一新的2ml收集管（提供），丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，重复该步骤一次；小心打开柱子的盖子，加入500μl AW1液，盖上盖子，600