二、GFP在生命科学研究中的应用.pdfVIP

生生命命奥奥秘秘wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 5. /2008/ 10/08/2008-nobel-prize-in-chemistry-to-gfp/ 6. The Nobel Prize in Chemistry 2008, The Royal Swedish Academy of Sciences, 1-7. www.kva.se 7. Roger Tsien. (2007) Roger Tsien: bringing color to cell biology. A passion for chemistry, color, and conversations with cells is what drives Roger Tsien. Interview by Ruth Williams, , 179 (1):6-8. 二、 GFP在生命科学研究中的应用 1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用 在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对 我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相 互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一 个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由 Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在 蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交 系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋 白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来 源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用， 人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作 用。 科学家利用两个增强型G F P （EG F P ） 片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系 图7 EGFP作为报告蛋白的酵母双杂交系统原理示意图。EGFP 统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水 的N-末端和C-末端分别与诱饵蛋白 （已知蛋白）和靶蛋白融合 平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的 表达。当诱饵蛋白与靶蛋白发生相互作用，荧光发色团就被拉 近，EGFP就发出荧光。 蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与 图片来源： 蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系 The Protein Journal 统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的 报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵 母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的 EGFP能够重新结合而发出荧光 （图7 ）。 1.1 构建分离的EGFP报告质粒 以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能 发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段 会再次互相结合从而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。构建模式见图8 。 在乙醇脱氢酶1 （A DH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端 （NEGFP, 1- 158位氨基 酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端 （CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被A DH1终 44 止子序列终止。 构建的EGFP报告质粒pNEGFP和pCEGFP分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝 数起始位点 （CEN6/A RS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了 酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点 （MCS ）还引入了Bam H I、Sal I 及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种 不同方法构建的EGFP报告系统，进行构象优化。 下文将以酵母GAL4