荧光共振能量转移-FRET在生物科学中的应用.pdfVIP

Review FRET 在生物科学中的应用 FRET 在生物科学中的应用 郑文富 学号 单分子与纳米生物实验室 荧光共振能量转移 （FRET）(Fluorescence / Förster resonance energy transfer)是 比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现 象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、 核酸与蛋白间相互作用以及其它一些方面的研究中得到广泛应用。 当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态1-3。光能可被生 色团在 10-15秒内吸收而在 10-9秒内再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将 能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这 后一种现象称为荧光共振能量转移 （FRET）。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体 激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。当FRET发生时，供体的荧光减 弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是 10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将 激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体 传递给受体，荧光光子由受体发出。 FRET发生的基本条件是：①、供体和受体的距离必须达到一定的数量级 （20-100À） ②、受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠。（见图 1）③、供体和受体能量转移偶 极子的方向必须近似地平行。Förster依据供体与受体的相对距离和偶极子的方向关系解释 了FRET发生的原理。能量转移的效率是有一些参数决定的1-3，下面方程给出了能量转移的产 效： 6 6 6 E=R 0/（R +R 0） R 是供体与受体在生物条件下的距离 R 是每对供受体之间的一个常数，代表能量转移的效率为 50％时的距离。R 称为Förster 0 0 临界距离，由下列公式计算： 23 2 4 1/6 R =[8.8х10 •κ •n QY •J(λ)] À 0 D 2 2 κ表示偶极子方向因子（范围从 0-4；当供体和受体的排列是随机时κ =2/3） QYD表示在没有受体时供体的量子产量 n 表示折射系数 J(λ)表示光谱重叠积分 J(λ) 其中： =受体淬灭系数 =总荧光强度中供体荧光强度部分 1 图 1：FRET 光谱重叠积分示意图 能量转移发生在供体受体距离在 0.5-10nM 之间。供受体分子之间存在电荷- 电荷库仑 力作用，激发态的供体对于受体的作用是偶极子-偶极子的电动力学空间作用。如果条件具 备：供受体的激发谱、吸收谱相互重叠，供体的量子产量和受体的吸收系数适当、方向合适 就极有可能发生能量转移。能量转移的速率和供受体的距离有函授关系 （与距离达到六次方 的倒数成比例）能量转移后供体回到基态、光子发射可能性减少，供体的激发态寿命减短， 受体可因受激发而发出光子，尽管起初是由供体激发的，我们检测到的荧光光谱却是由受体 发出的。 我们可以从能量转移的速率和效率得到许多信息：可以知道供受体的距离很近（约 0.5-10nM），得到距离的数量，有时能得到它们的方位关系。一般地每一对供受体可被分 别考虑，每对都由于其特殊的距离和方位和光谱特征而表现出其能量转移的可能性，这就使 我们能直接掌握