实验八总氮量的测定微量凯氏.docVIP

实验八 总氮量的测定——微量凯氏 （Micro-Kjeldahl） 2．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等 【原理】 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。 以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下： 测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。 本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应小于±2% 【操作方法】 一、样品处理 血清样品：取人血或猪血（蛋白质样品含水量一般为10%～12%），放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去血凝块，上层黄色透明清液，即为血清。吸出1ml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。溶液如显浑浊，加少量氯化钠，再混匀。 固体样品：测定某一固体样品中的含氮量，是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示（%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。 二、消 化 准备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入2ml稀释血清溶液（或4ml核酸制品溶液，或200mg固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入2ml水，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。 在每个烧瓶中加入约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用量筒加入化学纯浓硫酸3ml，将以上4个烧瓶放到消化架上（见图4-1），（如无消化架，可将烧瓶放在置于通风橱内或通风处的电炉上）进行消化。接好抽气装置，调节煤气量。先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重地影响样品的测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到使瓶内液体微微沸腾。假如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液体将它冲洗下来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的状况下大约维持6～8小时（对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要12小时）。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30%过氧化氢溶液1～2滴，加到瓶底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告完成（固体样品约需7小时）。为了保证反应的彻底完成，再继续加热消化1小时。消化完结，关闭煤气灯，使烧瓶冷却室温。 三、蒸馏① 1．仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。一般洗涤是先用水洗净棒状玻塞（见图4-2）周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品加入时立即放氨。 使用前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪器），加样前使蒸汽通过1～2min即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸-指示剂混合液中指示剂颜色合格为止，洗涤方法如下： 取2～3个50ml的维形瓶，加入5ml左右2%硼酸-指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器（见图4-2），器中盛有用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，并加几滴甲基红指示剂蒸馏器中还应放入一些毛细管，它们的长度必须超过液面，也可以用一些玻璃珠或小段橡皮管，它们都有防止爆沸的作用，关闭夹子9，使蒸汽通过反应室7中的插管10，进入反应室，再由冷凝器11的下端逸出。在冷凝器下端放一只空烧杯以承受凝集的水滴。这样用蒸汽洗涤5min左右后，在冷凝器下口放一个盛 ①蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影响实验结果的准确度。 有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶12，位置如图4-2，冷凝器下端应完全浸没于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min。观察锥形瓶中溶液是否基本上不