IgA肾病患者与健康人的尿液蛋白双向电泳图谱比较.pdf

· 868· 2(】l0年 l1爿第 26卷第 l1期 ChinJN · 短 篇 论 著 · IgA肾病患者与健康人的尿液蛋 白双 向电泳 图谱 比较 祁爱蓉 李顺 民 沈立 明 在临床蛋 白组学研究中，由于尿液可以无创 、大量获 述各实验步骤 ，提取蛋 白尿阴性患者和健康对照者尿蛋 得而倍受研究者青睐。本研究比较 IgA肾病 (IgAN)蛋白 白，用 18cm，pH3～10的IPG胶条进行二维电泳时 ，400 尿阳性 、蛋白尿阴性患者和健康人3种尿液标本的2一DE g左右上样量 、60000Vh左右的等电聚焦 ，得到了较为 图谱 ，并分析其 中2种差异蛋 白的功能 ，探讨 IgAN患者 满意电泳图谱 ，见图 1。经软件分析确定差异明显的20个 的尿液蛋白图谱的特点及其临床意义。 蛋 白点中，上调 的标记点：3、9、11、13、15、16、18号蛋 白； 一 、 对象与方法 下调的标记点 ：1、2、5、6、7、8、l0、12、14、l7、19号蛋 自； 1．研究对象 ：以2006年 1月至 2007年 8月间我院 尿蛋 白阴性组患者没有的点是4、20号蛋 白。此外从放大 确诊的20例 IgAN患者为研究对象 ，其中蛋 白尿阴性和 的图示 中可以看出4、20号蛋 向点在尿蛋 白阴性组患者 阳性者各 1O例，健康对照者 1O例。收集上述受试对象的 出现 明显低表达 。 清晨中段尿用作蛋白组学研究。 3．尿蛋 白阳性组患者与尿蛋 白阴性组患者的蛋 白图 2．主要仪器及试剂 ：美 国 GE Heahhcare公司 Ettan 谱比较 ：见网2。蛋 白尿阳性组患者 17000以下的小分子 IPG phor3聚焦 系统 ；EttanDALTSixeleetrophoresisUnit 量蛋白点明显多于尿蛋 白阴性组患者 ．且尿蛋 白阳性组 灌胶 及 电泳 系统 ；Proxpress2Dproteomicimagingsystem 患者 1O号与 l号(软件分析 1号蛋 白确有降低)蛋 白的 PerkinElmer扫描仪 ；ImageMaster2-D5．0分析软件 ；pH 3～lOl8cm线性 DH梯度 (immobilizedpHgradient，IPG) 等。 3．标本的收集及处理 ：收集晨起 中段尿液 200m1． 1500xg、4~C离心 5min，弃去细胞核及碎片 ，上清液置于 射线灭菌 的50mlEppendorf离心管中，每 1Oml加人 100 l的Thymol(1g／L)防腐 ，一80℃冻存备用。复融后参 照文献 【l】加入蛋 白酶抑制剂 ，将上述尿液 以 12500xg、 4℃离心 5min，弃去沉淀。经 minipore尼龙式针头过滤器 进一步除盐 、除菌 ，然后以75％乙腈萃取 ，加蛋 白裂解液 (尿素 7mol／L，硫脲 2molL／，CHAPS4％。riffs40mmolL／， IPGbuffer1．5％，DTI1．5％)1．5lTll左右 ，彻底提取管内 黏附的蛋白，置冰上高效透析8h，勤换透析水。最后所得 样品聚乙二醇浓度在 1g／L以上，分装一8O℃保存备用。 尿蛋 白阴性患者 Bradford法进行蛋 白定量 ，以 400Ixg为上样量 ，进行双向 凝胶 电泳并获取图像。 二、结果 1．蛋 白尿阳性患者的混合尿液样品的双向电泳图谱 与 10例患者 中随机抽取的尿液样品分别进行双向凝胶 电泳并获取图像 ，其图谱的重复性很好。 2．采用固相 pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一 聚丙烯酰胺凝胶 (T=10％)的垂直电泳为第二 向，按照上 DOI：10，3760／cma．j．issn．1001—7097．2010．11．016 基金项 目：国家 自然科学基金 ；深圳市科技局资 助项 目(200644) 作者单位：518033深圳，广州中医药大学深圳附属医院肾病