单细胞碱性凝胶电泳用于检测小鼠胸腺细胞DNA链断裂研究分析论文.docVIP

单细胞碱性凝胶电泳用于检测小鼠胸腺细胞DNA链断裂 吴庆四 徐迎春 姬艳丽 杨媛媛 姚余有 摘要 目的 引进单细胞凝胶电泳（Single-cell gel electropherosis SCGE）实验方法，用以检测小鼠胸腺细胞DNA链断裂。方法 载有胸腺细胞和凝胶的玻片首先在pH10的弱碱性裂解液中作用1h，在电泳缓冲液中解旋30min，电泳30min，胸腺细胞核用20ug /ml的EB染色5 min，观察H2O2和紫外线在体外条件下对正常胸腺细胞的DNA损伤作用。 结果 不同浓度H2O2 0.001、0.01、0.1、1.0mmol/L和紫外线均可导致小鼠胸腺细胞DNA损伤。结论 SCGE可用于检测小鼠胸腺细胞DNA链断裂，使用这一实验方法成功地检测出H2O2和紫外线引起的胸腺细胞DNA损伤。 主题词 胸腺 脱氧核糖核酸 中图分类号 Q523 Q456 文献标识码 A 胸腺是人体的主要器官，骨髓干细胞在胸腺逐渐发育为成熟 T淋巴细胞，并进一步分化为TH、TS、TC细胞。研究表明胸腺细胞DNA损伤可导致机体免疫功能下降[1]。为了更好地研究环境因素引起机体免疫功能下降的机理，建立胸腺细胞DNA损伤检测方法有着十分重要的意义。 单细胞凝胶电泳试验（Single cell gel electropherosis，SCGE）或称慧星试验（comet assay），是一种直接在荧光显微镜下用肉眼观察单个细胞DNA链断裂的试验方法[2～4]，由于SCGE有快速、简便和灵敏的特点，故本文拟用SCGE技术建立观察胸腺细胞DNA损伤方法。 1材料和方法 1.1 试剂 正常溶点琼脂糖（生化试剂），杭州微生物试剂厂；低溶点琼脂糖（Biotechnology Grade），北京经科宏达生物公司；H2O2(AR)，汕头市西陇化工厂产品。 基金项目：安徽医科大学校基金 作者单位：安徽医科大学检验医学系，合肥，230032 作者简介：吴庆四，男，28岁，助教； 姚余有，男，37岁，副教授，硕士生导师，通讯联系人 1.2 仪器 Nikon AFX-ⅡA型荧光显微镜，由日本Nikon公司生产。 1.3 标本来源及处理 细胞来自昆明种小鼠，取出胸腺细胞，加入Hank，S 应用液，分散细胞后过200目筛网，1000转/min离心10 min，调节细胞密度至2×106/ml；部分样品放在30W紫外灯距离25cm处照射10 min，另一部分样品分别用0、0.001、0.01、0.1、1.0mmol/l H2O2 37℃处理2h。 1.4 制片 选用的载玻片单面加水磨沙应均匀分布，先在磨沙面上铺上110ul 0.75%的正常溶点琼脂，盖上冷冻的盖玻片，在4℃静置10min，为底层凝胶，6ul胸腺细胞悬液（2×106个/ ml）与54ul 0.75%的低溶点琼脂在37℃条件下充分混匀后，立即铺在底层凝胶上，在4℃静置15 min，75ul 0.75%的低溶点琼脂铺在第二层凝胶上，在4℃静置20 min为顶层凝胶。 1.5 细胞裂解 移去胶板上的盖玻片，将胶板浸入新配制的裂解液（2.5 mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris、1%硫氰酸肌氨酸钠、1%tritonX-100、DMSO、 pH10）中4℃条件下作用1h，用PBS冲洗。 1.6 单细胞凝胶电泳 裂解后玻片置于水平电泳槽内，使弱碱性（pH10）电泳缓冲液（100mmol/L Na2EDTA）盖过胶面约0.25cm，电泳槽置于4℃静止30 min，使DNA充分展开。在30V，200mA， 4℃条件下电泳30 min，PBS冲洗后用20ug/ml的EB染色、封片。 1.7 结果观察 使用绿色激发光，在Nikon荧光显微镜下选择无重叠、荧光信号强的胸腺细胞核观察，根据慧星尾部DNA含量将胸腺细胞核DNA损伤程度分为5级[5，]，0级：〈5%，无损伤，核完整；1级：5%~19%，轻度损伤，可见慧星，核基本完整；2级：20%~39%，中度损伤，可见明显慧尾，核缩小；3级：40%~95%，程度损伤，慧尾荧光信号强而密，并见明显缩小的核；4级：〉95%，完全损伤，仅见荧光强而密的慧尾，核基本消失。 2结果 2.1 细胞存活率 按照方法中描述的程序分离小鼠胸腺细胞，镜下可观察细胞呈圆形、折光性好，台盼兰染色示存活率达95％以上。 2.2 H2O2及紫外线对胸腺细胞DNA的影响 将染色后的标本置于荧光显微镜下，100瓦汞灯作为光源，选择使用绿色激发光，在荧光显微镜下进行观察。图1为完整胸腺细胞，只见一个明亮的荧光头；图2～5为DNA链断裂的细胞，在细胞核的一侧可见一些带有红色荧光的颗粒，即游离出细胞