猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

中国兽医科学 2009，39(02)：168—172 ChineseVeterinaryScience 中图分类号 ：Q511：Q503 文献标志码 ：A 文章编号 ：1673—4696(2009)02—0168—05 猪 IFN-7mRNATaqMan荧光定量 RT—PCR 检测方法的建立 韦天超 。，田志军 ，周艳君。，安同庆 ，肖 燕 ，彭金美 ，姜一峰 ，童光志 (1．中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术 国家重点实验室 猪传染病研究室 ， 黑龙江 哈尔滨 150001；2．中国农业科学院 上海兽医研究所 ，上海 200232； 3．广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005) 摘要：为建立一种检测猪 7L干扰素 (IFN一)，)的荧光定量 RT—PCR方法，针对猪 IFN一)，基 因和管家基 因 cyclophilinA(CyPA)的核苷酸序列分别设计 了特异性 引物和 TaqMan荧光探针，以重组质粒 pMD18一T— IFN—y和 pMD18T—CyPA为标准品，进行实时荧光定量 RT—PCR检测，并构建猪 IFN—ymRNA和 CyPA的 荧光定量RT—PCR标准曲线。结果表 明，建立的方法在 1×10～1×10copies／L模板范围内具有 良好的 线性关系，相关系数 r均高达 0．999，扩增效率均高于 99．0 ；可检测至少为 100copies的FEl性标 准品。该 方法具有快速 、敏感性高、特异性强和重复性好等特点，可应用于临床样品的检测。 关键词 ：猪 ；IFN—y；荧光定量 RT—PCR；TaqMan荧光探针 DevelopmentofaTaqM an fluorescentquantitativeRT-PCR assay fordetectionofporcineIFN— mRNA WEITian—ehao～，TIAN Zhi—jun ，ZHOUYan—jun ，ANTong—qing ，XIA0Yan ，PENGJin-mei， JIANG Yi—feng ，TONG Guang—zhi (1．StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology／DivisionofSwineInfectiousDiseases。HarbinVeterinary ResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China：2．Shanghai VeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai200232，China； 3．CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China) Abstract：ToestablishafluorescentquantitativeRT PCR assayfordetectionofporcineinterferon—y (IFN一)，)，specificprimersandfluorescentprobesbasedonporcineIFN一)，geneandhousekeepinggenecyclo— philinA (CyPA)weredesigned，respectively．Using theplasmidspM D18一T—IFN一)，andpMD18-T—CyPA as standardproducts，areal—timequantitativeTaqMan reverse transcription—polymerasechain reaction(RT— PCR)wasperformed to constructthestandardcurvesofporcineIFN—yandCyPA．Theresultsindicated thattheassayforthequantitationofporcineIFN一)，templateworkedwellfrom 1×10 to1×1