柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游.pdfVIP

中国水产科学 2011 年9 月, 18(5): 1100−1107 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.01100 柱状黄杆菌乙酰辅酶A 合成酶基因及其上游调控序列分析 张金, 邹红, 姚卫建, 聂品 中国科学院 水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 湖北 武汉 430072 摘要: 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操 作系统的研究进展较慢, 而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达, 有可能促进该细菌遗传操 作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A 合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene, acs) 的编码序 列及其上游调控序列, 该基因全长2 323 bp, 编码635 个氨基酸。通过序列分析, 发现在该基因起始密码子ATG 的 上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site, RBS)序列TAAAA, 和启动子–7 和–33 的保守基序TATTTTCG 和 TTG 。将acs 的上游调控序列(promoter sequence, Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicol acetyltransferase, cat) 的上游并导入柱状黄杆菌G4 株后, cat 基因得以表达, 并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5′ RACE 技术, 确 定了外源的cat 基因和内源的acs 基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游46 bp 处的T 。通过删减分析调控 序列 Pacs , 发现起始密码子上游 164 bp 的序列是保持启动子活性所必需的。通过分析和比对32 个基因的核糖体 结合位点区域, 在起始密码子上游 10 bp 处发现了RBS 保守基序TAAAA 。 关键词: 柱状黄杆菌; 乙酰辅酶A 合成酶基因; 启动子; 核糖体结合位点 中图分类号: S941 文献标志码: A 文章编号: 1005−8737− (2011)05−1100−08 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)隶属 有利于实现外源基因在柱状黄杆菌细胞内的表达。 于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科, 是 乙酰辅酶 A 是生物体内重要的化学物质, 它 淡水鱼类的重要致病菌, 它引起的柱形病在世界 是丙酮酸氧化脱羧和脂肪酸 β-氧化的产物, 也是 范围内都有报道[1] 。患柱形病的鱼往往出现烂鳃、 脂肪酸合成、胆固醇合成和酮体生成的碳来源。 体表溃疡、鳍条腐烂等症状, 且有很高的死亡率, 蛋白质、糖、脂肪这三大类营养物质最终都会被 给养殖生产带来巨大的经济损失[2–3] 。柱状黄杆菌 彻底氧化成乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环, 为生物 是噬纤维菌属(Cytophaga) 、黄杆菌属(Flavobac- 体提供能量, 或者通过乙醛酸旁路产生生物合成 terium)和拟杆菌属(Bacteroides)家族(CFB) 的一个 所需的物质[10] 。乙酰辅酶A 有以下2 种合成途径: 成员。到目前为止, 对这些细菌遗传操作系统的 乙酸在乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的作用下转化成 构建进展缓慢, 尽管已有关于柱状黄杆菌遗传操 乙酰辅酶 A; 通过乙酰辅酶 A 合成酶(acetyl- 作系统的报道[4] 。在变形菌中经常使用的质粒、 coenzyme A synthetase, ACS)一步将乙酸转化成乙 筛选标记和启动子等都不能在这类细菌中有效地 酰辅酶A[11] 。由于ACS 参与乙酰辅酶A 的合成, 发挥作用[5–7], 因为这些广泛应用的遗传元件的启 与生物体的新陈代谢相关, 因此推测柱状黄杆菌 动子在CFB 家族细菌中基