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实验12 蛋白表达的SDS检测 实验目的： 使学生掌握蛋白质电泳检测常用技术：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS），以及聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue ，R-250 ）染色技术。同时此实验还要学生掌握如何检测分析蛋白原核表达的状态， 即判断蛋白原核表达部位：培养液（medium ）、可溶性胞质部分（soluble fraction ）、周质部分 （periplasmic fraction ）、包涵体部分（insoluble fraction ）。 实验原理： 聚丙烯酰胺（polyacrylamide ，PAA ）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr ），在交联剂甲叉双 丙烯酰胺（bisacrylamide ，Bis ）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物（图12-1）。 图12-1 丙烯酰胺的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基， 过硫酸铵（ammonium persulfate，APS ）和N ，N ，N′，N′- 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine ， TEMED ）就是这样的催化诱发系统。聚丙烯酰胺的聚合反应是通过加入过硫酸铵启动的，添加 TEMED 加速聚合反应。过硫酸铵提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基。诱发剂TEMED 能加速过硫酸铵形成自由基，使丙烯酰胺单体转变为自由基态。被激活的单体和未被激活的单 体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互连 成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。溶液的pH 对聚合作用是重要的，因为过低pH 没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝 胶时，在加过硫酸胺之前，混合物必须抽去空气。 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于 SDS 和巯基乙醇作用，使得蛋白质分子中二硫键还 原，氨键、疏水键打开，SDS 按 l.4g SDS/1g 蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成 SDS-多肽复合物。因十二烷基磺酸根带负电，使各种SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷。 它的量大大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子问原有 的电荷差别。同时，在水溶液中，SDS-多肽复合物具有近似的形状(长椭圆棒状) ，并且不同SDS- 多肽复合物的短轴长度趋于一致，而长轴与分子量成正比（图12-2）。这样。SDS-多肽复合物， 在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分 子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子 筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。因此，样品分离效果好，分辨率高。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于凝胶中聚丙烯酸胺的浓度和交链数量。在没有 交链剂的情况下，丙烯酰胺的聚合反应形成黏性溶液，这种溶液是没有实际应用价值的。双丙 烯酰胺形成的交链增加了凝胶的硬度和韧性，形成了SDS-多肽混合物通过的孔。这些孔的大小 随着双丙烯酰胺：丙烯酸胺比例的增加而变小，当这个比例达到约 1 ∶20 时这些孔的孔径达到 最小。大多数SDS-聚丙烯酰胺凝胶是由一摩尔的双丙烯酰胺与29 摩尔的丙烯酰胺所组成，这 是一个能够按大小分辨多肽而误差小于 3 ％的经验比例。这样，凝胶的过滤性质是由孔的大小 而决定的，而这些孔的大小是由加人到凝胶中的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的绝对浓度所决定的。 凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同 SDS-多肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效应 （图12-3）。微孔的大小由于Bis 和Acr 的比例和凝胶的浓度决定。 表12-1 列出了凝胶浓度与有效分离范围。 图12-4 显示了不同浓度聚丙烯酰胺凝胶对同一样品中各蛋白组分的分离效果。 表12-1 蛋白质在聚丙烯酰胺的有效分离范围 凝胶浓度（％） 分离范围 （kDa ）