环介导等温扩增的评价在快速检测丛枝菌根真菌中的应用.docVIP

环介导等温扩增的评价用来快速检测丛枝菌根真菌 食品科学与工程学院 生物工程081 杨娟 2084308111 在2007年7月5日投稿，2007年8月10日收修订的通知，到2007年8月28日正式刊登，2007年9月21日在网络上提供 摘要 对丛枝菌根真菌的检测和量化是对任何与共生菌相关的工作都是重要的。在这里，我们应用环介导扩增（LAMP），等温DNA扩增技术，在体外条件下培养丛枝菌根真菌（AMF）。环介导扩增技术第一次应用在丛枝菌根真菌，我们引用环介导扩增的底物，它能够扩大从胡萝卜的根部移植来的丛枝菌根真菌DNA，和几个类群的丛枝菌根真菌提取的基因组DNA（低至模板为10-2纳克）。这项研究是再更具挑战性的环境条件下进行检测这种方法的新起点。 2007年爱思唯尔有限公司保留所有权利。 关键词：环介导扩增（LAMP），丛枝菌根;血管球;检测;根定植 正文 丛枝菌根真菌(AMF)是无处不在的共生植物根系，它对陆地生态系统产生广泛的影响（Rillig;2004）。对丛枝菌根真菌研究的一个必不可少的先决条件是他们可靠的检测，检测也有很多方法（Vierheilig et al.,2005）。经常使用的技术大多是基于对真菌的代谢物或在根部的真菌结构的微观评估的量化。已经有越来越多的兴趣在分子检测工具上（例如.,Alkan et al.,2004,2006）,因为有区分和鉴定丛枝菌根真菌群的根内菌丝的可能性，其他的检测方法检测范围有限。最近，定量检测丛枝菌根真菌与土壤和植物的共生体系的方法已经被提出采用实时定量聚合酶链式反应的方法来检测。这种技术使得样品中大量的现有目标生物的量化具有高的精确度和灵敏度。然而，这种方法的广泛应用是不可能应用在某些领域的比如生态学，那些大量的样品可能带来很高的分析费用。因此，能够快速检测大量样品，又节约成本，简单，快速的DNA扩增方法是必要的。 最近快速发展起来的检测技术，环介导等温扩增DNA（LAMP），是一个既有灵敏度和速度，又相对便宜的一种方法。环介导等温扩增DNA依赖于利用具有链置换属性的BstDNA聚合酶促使DNA自动环化的DNA的扩增。环介导等温扩增DNA需要两个经特别设计的外引物和两个内引物，可以使得扩增目标DNA具有高度的特异性，并且在等温条件下更快速、高效。由于环介导等温扩增DNA是在60—65摄氏度的等温条件下进行反应的，因此简单的培养箱对DNA的扩增就足够了。环介导等温扩增DNA产生大量的焦磷酸离子，它可以与反应混合物中存在的镁离子形成焦磷酸镁，一个白色沉淀的副产品（Mort et al.,2001）。这使得在视觉上能够快速和简便的鉴定通过环介导等温扩增的目标DNA。 环介导等温扩增DNA的方法很少被应用到土壤，根系或土壤生物，也没有应用到丛枝菌根真菌上。因此，我们目前的工作就是追求两个目标：大体上提高这种方法在土壤生态的潜在作用上的认识和为了基于环介导等温扩增DNA用于丛枝菌根真菌的检测系统的发展奠定基础。 使用如前面过程所述的方法对丛枝菌根真菌Glomus intraradices (DAOM 181602),G. intraradices (MUCL 43194), Glomus proliferum(MUCL 41827), Glomus lamellosum (MUCL 43195),Glomus celebriforme (MUCL 43208) and Gigaspora roseaNicolson and Schenck (DAOM 194757)的培养与胡萝卜毛状根的衍生的Ri T—DNA有关（Gadkar ang Rillig,2005）。 丛枝菌根真菌孢子通过凝胶剂的消融在分裂板上获得（Phytagel），使用10毫摩尔，PH为6的柠檬酸盐缓冲液就可以被发现（1991）。从胡萝卜的根部移植双重培养的G. intraradices，有着不同的年龄和移植率也被使用。根染色（菲利普斯和海曼，1970）和被移植的根的比生长速率也被测定（纽曼，1966）。 我们选择的G. intraradices?-微管蛋白基因（GenBank accession no.BE603903）去设计环介导等温扩增DNA的引物。引物的序列也通过引物探测V4软件程序深度分析（http://primerexplorer.jp/e/index.html）然后设计环介导等温扩增DNA的引物：AMB-F3（前内引物）、AMB-B3（后内引物）、 AMB-FIP（前外引物）、AMB-BIP（后外引物）。此外，那个能够识别目标DNA模板链和反义链的每一个内部引物与T盒结合。引物定制合成。 从G. intraradices单独的孢子分离得到的染色体组的DNA和前面描述的很像。同样用Qia