22 免疫学检测技术的基本原理.pptVIP

细胞因子检测 生物活性检测法 免疫学检测法 夹心ELISA或ELISPOT 荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析 细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株 细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤 检测B细胞产生的抗体 检测T细胞产生的CK 酶联免疫斑点试验-ELISpot 第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 第二节 检测抗原和抗体的体外试验 第三节 免疫细胞功能的测定 第22章 免疫学检测技术的基本原理 第一节 体外免疫反应的特点及影响因素※※ (一)抗原抗体反应的特点 高度特异性 特异性越强，亲和力也越高； 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等非共价结合。不如共价键稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性； 适宜的抗原抗体浓度和比例 决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应； 抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。 (二)抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。 第二节 检测抗原和抗体的体外实验 Ab Ag 高亲和力 Ab Ag 低亲和力 特异性 结合力的表示方法 亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab反应的原理 Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络 Ag-Ab反应的可见性 1.凝集反应 直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。 玻片法 试管法 常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定 常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。 间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断： + 病人的RBC 体内anti-Rh 由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集 + 体外加入抗人IgG 出现凝集现象，叫直接库姆试验 正常人O型血的Rh+的RBC + 患者血清内的游离anti-Rh + 体外加入抗人IgG 出现凝集现象，叫间接库姆试验 2.沉淀反应 Ag Ag Ag Ag Ab in gel 单向免疫扩散 Ag1 Ab Ag2 Ag3 Ag4 双向免疫扩散 免疫比浊 过量Ab Ab Ab Ab 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。 鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同 用于确定抗原浓度 沉淀反应—免疫电泳 存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。 3.免疫标记技术 免疫酶测定法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 免疫胶体金技术 ①免疫酶测定法 夹心法ELISA 间接ELISA BAS—ELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。 a） b） 免疫组化技术 定位、定性、定量检测 ②免疫荧光技术 ③放射免疫测定 用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。 ④化学发光免疫技术 将化学发光分析和免