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第六章 基因的分离与鉴定 第一节 基因的分离与鉴定方法 一，获得基因的一般方法 1.化学合成法 主要用于较小基因合成，或需改变密码子的基因。 2.半化学合成法 mRNA→cDNA →加人工接头/合成一段DNA →与载体相连 3.筛选法 用于各种方法从基因组文库中选择目的基因。 4.采用PCR技术从基因组或总RNA扩增基因。 二，基因的筛选方法 1.遗传互补法 （1）原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带有决定新性状的遗传基因。 ①营养缺陷型受体细胞+外源细胞→转化细胞涂布在合成基本培养基上→原养型细胞生长 ②受体细胞（无某种表型）+外源DNA →转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞 ③虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，也可用于基因筛选 实例 ①基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（Leu-）→转化细胞（Leu+） →LEU基因 ②基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性） →转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，首选方法，获得的基因一定是完整的基因 缺点：适用范围较窄，酵母菌的基因能使E.coli缺陷型互补，有的高等植物的cDNA文库也能使E.coli营养缺陷型互补。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。 （2）分离步骤 分离纯化基因组文库重组DNA分子→转化适当的宿主细胞→涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分别重组DNA分子→再转化相同受体细胞→高频转化子→基因的进一步证实和鉴定 2.核酸杂交法 （1）原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特定分离目的基因，蛋白质的基因在不同的生物中具有保守性。 优点：不需要基因表达 必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增。 （2）核酸探针的种类 ①DNA探针 ②寡核苷酸探针 ③cDNA探针 ④RNA探针 （3）分离步骤 基因文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→作斑点和Southern杂交确认杂交结果→DNA进一步证实和鉴定，核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫法或其他方法检测表达产物 3.免疫法 （1）原理 外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，此为抗原与相应的抗体发生免疫反应，然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA。 优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性 必备条件：待分离基因的表达产物蛋白质，必须纯化和用于制备相应抗体。 （2）分离步骤 基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑点（阳性克隆） →进一步证实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，Western印迹 4.染色体步查法 （1）原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两端片段为探针。 优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序列测定十分有用。 缺点：工作量大，鉴定困难。 必要条件：两基因间距离清楚。 * * 基因的分离与鉴定方法 真核生物基因克隆的实例 染色体自主复制顺序的分离与鉴定 着丝粒DNA的分离与鉴定 端粒DNA的分离与鉴定? *