猪血清IgG的分离纯化及鉴定51257.pptVIP

IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，SDS电泳呈现两条较浓的条带。 猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后，所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。 这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我们想得更多，学得更多，得到的也更多。在我们开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展提供了有力的基础。 * * 组员：陈忠浩 、赵静杰、郭献贵、于芳萍 发言人：郭献贵 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 Contents 材料与方法 结果与讨论 总结与感想 一、材料与方法 （一）试验材料 1、供试材料 采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h，析出血清，于4℃、8000r/min离心10min，除去血球和纤维蛋白原后，取上层血清，-20℃冰箱内保存备用。 2、主要试剂 上海光铧科技有限公司 衢州巨化试剂有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 上海三鹰化学试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司 杭州瓶窑和顺化工试剂厂 浙江中星化工试剂有限公司 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 三氯醋酸 正辛酸 氯化钠 氢氧化钠 盐酸 Tris 无水乙醇 醋酸 出产厂家 规格 试剂名称 浙江中星化工试剂有限公司 无锡市龙吉化工试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司 上海源聚生物科技有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 浙江中星化工试剂有限公司 安徽三星树脂科技有限公司 上海三鹰化学试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 考马斯亮蓝 甘油 巯基乙醇 SDS 甘氨酸 溴酚蓝 DEAE52 过硫酸铵 乙酸钡 出产厂家 规格 试剂名称 3、仪器设备 上海亚荣生化仪器厂 90-2 恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂 Φ1.0×30 层析拄 梅特勒托利多仪器(上海)有限公司 DELTA-320 酸度计 上海新苗医疗器械制造有限公司 OHG-907385-Ⅲ 电热恒温鼓风干燥箱 上海沪西分析仪器厂 MC99-3 自动液相色谱分离层析仪 上海福玛实验设备有限公司 QYC-211 全温振荡（空气）培养箱 梅特勒－托利多仪器有限公司 AB-L 电子精密天平 上海一恒科技有限公司 DZF-6050 真空干燥箱 常州国华电器有限公司 HH-2 数显恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司 FW100 高速万能粉碎机 上海安亭科学仪器厂 TDL-5 低速大容量离心机 上海精密科学仪器有限公司 CS101 电泳仪 恒达仪器厂 S52 紫外可见分光光度计 生产厂家 型号 仪器名称 A 猪血清IgG的提取 B 猪血清IgG的纯化 C 提取液蛋白含量测定 （二）试验方法 D 猪血清IgG分子量测定 1、猪血清IgG的提取——正辛酸法 准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中，加入60mmol/L pH4.0醋酸缓冲液160mL，用氢氧化钠溶液调pH4.5。 以每毫升稀释液加入25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃，5000 r/min离心30min，弃去沉淀。 上清液4℃预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min，5000r/min离心15min。 将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为粗提IgG。 2、猪血清IgG的纯化 将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋，悬于装有0.01mol/L，pH7.4的PBS的大烧杯中，于磁力搅拌器上4℃透析24h，每6h换一次液。 （1）透析脱盐 取2g预处理的DEAE-52纤维素、装成1.5×30cm，柱床高25cm层析柱。 缓冲液A(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8，35mmol/L NaCl)平衡。 取2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A平衡，至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止。 以等量缓冲液A和缓冲液C(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8， 500mmol/L NaCl)连续梯度洗脱；控制流速1mL/min。 上样15min后分步收集并记录波峰，2mL/管，合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析，并进行分析鉴定。 （2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化IgG 3、提取液蛋白含量测定——Folin-酚法 配制标准牛血清白蛋白进行F