生物分离纯化与技术.pptVIP

猪胰蛋白酶的分离与纯化 主要内容： 一、胰蛋白酶的基本特性 二、采用的分离纯化方法的原理 1. 沉淀法 2.透析法 3. 离子交换层析技术 4.亲和层析法(进一步纯化） 三﹑胰蛋白酶的分离纯化 四﹑蛋白质含量的测定 五﹑酶活力的测定 一、胰蛋白酶的基本特性 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。 猪胰蛋白酶的分子量约为23.4 kDa，其等电点约为pI=10.8，最适pH7.6～8.0， 胰蛋白酶在pH=3左右较稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。 二、分离纯化应用的一些方法原理 盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。 二、分离纯化方法的原理 由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶质（如无机盐）透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。 二、分离纯化方法的原理 同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pHpI），带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pHpI），带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。 通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。 二、分离纯化方法的原理 4.亲和层析法: 一、猪胰蛋白酶的分离纯化 （1）粗猪胰蛋白酶的提取 （2）透析 （3）离子交换法纯化猪胰蛋白酶 ( 4 ) 亲和层析法纯化猪胰蛋白酶 1.粗猪胰蛋白酶的的提取 一、猪胰蛋白酶的分离纯化 将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！）。 在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换液1次 ！） 而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！） （记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时SDS化） 离子交换层析法初步纯化猪胰蛋白酶 柱的平衡：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱 样品吸附：直接上样于CM-纤维素离子交换柱 洗涤：用0.01mol/L，PH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白 洗脱1：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲液洗脱并分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为留样4），此峰为猪胰凝乳蛋白酶。 洗脱2：待猪胰凝乳蛋白酶后改用用0.1mol/L,PH6.0柠檬酸钠缓冲液洗脱，此时出现一洗脱峰，并收集洗脱测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为留样5），此峰为猪胰蛋白酶。 再生柱子（0.5mol/LNaOH) 用蒸馏水洗至中性 二、蛋白质含量的测定 方法：紫外吸收法 所测样品： 猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5，用来计算比活和纯化倍数； 离子交换层析过程中的分部收集样品，用来作层析曲线（以样品管号为横坐标，以A280为纵坐标作曲线） 三、胰蛋白酶活性测定原理 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择性。 胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。 活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液在280nm处吸光度A280增加一个单位的酶量为一个