酶学第五章酶的分离纯化与制剂.pptVIP

主讲教师：赵丹丹 第五章 酶的分离纯化与制剂 第五章 酶的分离纯化与制剂 主要内容：酶分离纯化的一般原则、酶的抽提、酶的纯化原理与方法、酶的纯度与产量、酶的纯度与产量、酶的剂型与保存 第一节 酶分离纯化的一般原则 预防蛋白质变性失效的方法与措施 主要内容：防止酶变性失效 选择有效的纯化方法 酶活性测定贯穿纯化过程的始终 一、酶分离纯化的概述 酶工业生产中属于下游技术！ 最终目的（ ） 整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液； (2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去； (3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。 一、酶分离纯化的概述 3. 酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点： (1) 特定的一种酶在细胞中的含量很少； (2) 酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。 二、防止酶变性失效 除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心； 大多数酶在pH＜4或pH＞10的情况下不稳定，应控制整个系统不要过酸、过碱，同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量； 酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成； 重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。 三、选择有效的纯化方法 酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各种“激烈”手段。 由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化。这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。 四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终 酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。 从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。 第二节 酶的抽提 抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。 主要内容：预处理和破细胞 抽提 浓缩 一、预处理和破细胞 着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将完整材料立即冰冻保存。 一、预处理和破细胞 3. 根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。 (1) 细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题； (2) 细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。 ‘‘周质酶”（periplasmic enzyme）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放； “膜结合酶’’（membrane-binding enzyme）则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题。 一、预处理和破细胞 4. 细胞破碎（cell disruption） (1) 机械破碎法 机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器 研磨法 匀浆法 高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效； 加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。 在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶解处理。 一、预处理和破细胞 4. 细胞破碎（cell disruption） (2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥