多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡中的氧化—抗氧化失衡研究.DOCVIP

临床医学论文-多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡中的氧化—抗氧化失衡研究 【摘要】? ［目的］ 探讨多西紫杉醇在诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中细胞氧化应激以及氧化—抗氧化失衡情况。［方法］ 取体外培养的对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养细胞暴露于10-8mol/L多西紫杉醇，24h后在荧光显微镜下检测细胞凋亡形态，并利用流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及谷胱甘肽(glutathion，GSH)水平。［结果］ SMMC-7721细胞暴露于10-8mol/L多西紫杉醇24h后发生凋亡，细胞内活性氧为68.43%±10.47%， 显著高于对照组20.32%±3.52%(P0.001)。细胞内GSH水平4.5±1.2 fmol/cell，显著低于对照组11.5±2.5 fmol/cell (P0.05)。［结论］ 多西紫杉醇诱导细胞凋亡过程中存在氧化应急以及氧化—抗氧化失衡，ROS可能参与了细胞凋亡的过程。 【关键词】? 多西紫杉醇 肝肿瘤 细胞凋亡 活性氧 谷胱甘肽 ??? 多西紫杉醇是紫杉类抗癌新药，目前多用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤。研究表明，多西紫杉醇对肝癌细胞有效[1,2]。本文研究了多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡作用，并且探讨了在此过程中细胞内活性氧的变化，以期从活性氧角度探讨该药的抗癌作用，为临床上应用多西紫杉醇治疗肝癌提供实验依据。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1.1?? 材?? 料 ??? 本实验在山东大学药理实验室完成，实验用多西紫杉醇(商品名:泰素帝)为安万特公司产品，20mg/支。2′，7′-二氯双氢荧光素二乙酸盐（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）和二氢乙啶（dihydroethidine，HE）购自Sigma(USA)公司。谷胱甘肽（glutathion，GSH）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所。SMMC-7721肝癌细胞由中科院上海细胞生物研究所提供。 ??? 1.2?? 细胞培养和处理 ??? SMMC-7721细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640(Gibco-BRL)培养液中，细胞置于37℃含5% CO2湿饱和的培养箱中培养，每3d传代一次。取对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养的细胞随机分成实验组和对照组。24h后实验组加入含有10-8mol/L多西紫杉醇（本实验中能够完全抑制细胞生长的最低药物浓度）的RPMI1640培养液5ml，对照组加入不含任何药物的RPMI1640培养液5ml，继续培养24h后进行下列实验。 ??? 1.3?? 荧光显微镜检测细胞凋亡 ??? 取实验组和对照组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤一次，取25μl细胞悬液加1μl吖啶橙和溴化乙啶混合液（吖啶橙 100μg/ml和溴化乙啶100μg/ml），细胞浓度1×106/ml，在荧光显微镜下（激发波长490nm）进行观察。 ??? 1.4?? 细胞内活性氧检测 ??? 取实验组和对照组细胞各6瓶，向培养液中加入DCFH-DA（终浓度5×10-6mol/L）和HE（终浓度10-5mol/L）细胞内活性氧捕获剂与细胞一起37℃孵育50min。孵育结束后收集细胞（约1×106）并悬浮于PBS，在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上使用氩离子激光（15mW），以随机波长488nm进行测定。绿色荧光（DCF）对应过氧化物水平通过530nm滤光片收集，而红色荧光(HE)代表超氧阴离子水平通过650nm滤光片收集。取1护细胞在BectonDic-kinson FACSCalibur流式细胞仪上检测各组荧光强度，激发光为氢离子激光波长488nm，数据采集和分析在Power Macintosh 7600/120计算机上用FAGS/CELLQuest软件(San Jose，CA)。实验组和对照组活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平用荧光强度±标准差来表示，两组之间比较用t检验。 ??? 1.5?? 细胞内GSH含量测定 ??? SMMC-7721细胞传代于培养瓶，实验组用10-8mol/L多西紫杉醇作用24h，对照组未给予多西紫杉醇处理，每组重复3次。用0.25%胰蛋白酶消化细胞并吹打成单细胞悬液，1 000r/min离心5min，细胞沉淀用适量生理盐水悬浮，镜下计数。然后1 000r/min离心,细胞沉淀加0.75ml蒸馏水再加0.25ml硫代水杨酸溶解，转移至1.5ml Ependorf管，12 000r/min离心5min，取上清液检测