茶树miRNA分离鉴定及其与茶尺蠖取食诱导差异表达特征研究.pdfVIP

摘 要 miRNA 是一类內源非编码的长度为20-25nt 的单链小分子RNA，其在植物体内 主要通过剪切mRNA对基因进行转录后调控，进而对植物生长发育和响应各种逆境 胁迫过程中发挥着重要作用，因而有关miRNA 的调控作用正成为关注热点。然而 miRNA在植物对害虫取食诱导防御机制中的调控研究甚少，同时也很少有茶树中的 miRNA序列被报道。因此本论文借助小RNA 深度测序、miRNA芯片和qRT-PCR 等 技术，并结合生物信息学分析手段，对茶树miRNA进行分离鉴定，在此基础上获得 茶树被茶尺蠖取食诱导相关的差异miRNA，以进一步明确茶树miRNA 特征及其被 茶尺蠖取食诱导的差异miRNA种类与功能。 论文获得的主要结果如下： （1）对茶树叶片的小RNA进行Solexa高通量测序，共获得有效序列8,796,700条， 占总读数的比例高达81.30%，对其进行miRNA序列分析发现，高拷贝读数（100 次）的miRNA 占总读数的27%。对不同拷贝数miRNA序列进行qRT-PCR验证发现， 其结果与与测序的拷贝数一致。 （2）在所获得的茶树miRNA 中，其中的253条属于保守miRNA序列分别隶属于30 miRNA 574 miRNA 16 个保守 家族， 条茶树特异的 序列；茶树保守家族中的 个家族 （miR156， miR166， miR535， miR6149等）成员数量明显高于拟南芥等其他植 物物种；生物信息学分析表明，很多茶树miRNA调控的靶基因与生长发育、次生代 谢、逆境响应及信号转导等功能相关。 （3）对测序获得的miRNA经过芯片鉴定后得出可靠的茶树miRNA169条，其中保 守miRNA为130条，茶树特有miRNA为39条。进一步分析发现，有35条miRNA 60 在叶部的表达量明显高于根部，有 条则呈相反规律。 （4）基于miRNA芯片筛选发现，茶树被茶尺蠖取食后，差异表达的miRNA共有29 条，其中下调表达的27条，上调表达的2条。在差异表达的miRNA 中，miR159， miR319 miR396 GA ABA ， 作用的靶基因具有调控防御反应、 、 等激素合成与代谢相 关等功能。 （5）从茶尺蠖取食诱导差异表达明显的miRNA 中，随机选择7条进行qRT-PCR验 证，结果发现，茶树分别被茶尺蠖取食和茶尺蠖口腔分泌液处理后，它们的表达量均 明显比各自的对照降低；而喷施MeJA处理后，发现其中的5条miRNA表达量也明 显低于对照。 关键字：茶树，miRNA，茶尺蠖，高通量测序，miRNA芯片，诱导防御 I Abstract MicroRNAs are a class of endogenous,non-coding single-stranded small RNAs that regulatenumerousgenesby guidingtargetmRNAcleavageinplant, andmiRNAsplay an important role in various aspects of plant growth and development process and environmentstressresponses.Soitisbecoming concerned focusabouttheregulationrole ofmiRNA.. However, little attetionhas been focused onthe function ofmiRNAinplant defensemechanismsagainstpests,andafewteamiRNAsequenceshavebeenreported. So the paper performed the small RNA deep sequencing, miRNA microarray, q