Ad介导G250基因转染DC激活免疫效应细胞治疗肾癌的实验研究.pdf

博士擘住论文 Ad介导G250基因转染DC 激活免疫效应细胞治疗肾癌的实验研究 博士研究生：齐桓 指导教师：郑少斌 摘要 据统计2006年美国约40000例肾肿瘤的新发病例被确诊，大约13000例患 者(包括成人和儿童)死于肾肿瘤。肾细胞癌是肾肿瘤中最常见的类型，占肾 脏恶性肿瘤的90％以上，晚期的转移性肾癌对放疗与化疗均不敏感，一小部分患 者对IL-2和IFN—a治疗有效，但药物的毒副作用十分明显。研究表明，肿瘤的 发生及发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，进一步的研究发现，导致 此缺陷的原因在于机体对成熟树突状细胞(Dendriticcell，Dc)的功能下调。 在体外，很多实验证实即使是晚期肿瘤患者外周血分离出的淋巴细胞对多种外 界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养Dc，诱导特异高效的 细胞毒性T淋巴细胞(cTL)，回输免疫患者，有望成为治疗肿瘤的绝佳疗法． 而目前最需解决的问题是：如何在已知靶抗原的前提下，获得良好活性、足够 数量的特异性cTL? Dc是人体内功能最强大的抗原递呈细胞。如能将肿瘤抗原成功加载Dc，可 诱导抗原特异的OFL。目前，采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte- macrophagecolonystimulating IL-4)已能成功从外周血单个核细胞培养出Dc。但是，如何能够有效地将抗原 导入DC?又如何有效利用Dc诱导T淋巴细胞产生CTL? 研究表明：不同的抗原加载方式，对Dc的活化效率不同，产生CTL的活性 中文摘要 也不一致。目前抗原加载存在着多种手段，常用的策略有：抗原肽致敏Dc及病 毒载体携带抗原基因转染Dc两种方式。 采用肿瘤抗原肽致敏Dc虽有抗原比较特异，可多次免疫等优点，但存在的 主要问题是：这类抗原肽往往半衰期较短，因此需要多次免疫方可获得良好活 性的CTL，而且转导效率低下． 病素载体携带抗原肽基因转染Dc，可使基因在Dc体内稳定表达，从而使 Dc获得持续而大量的抗原肽刺激，有望解决单纯抗原肽转导存在的问题。目前 转染Dc常用的病毒载体有：逆转录病毒，腺病毒和慢病毒等。腺病毒载体(Ad) 是常用的病毒载体之一．腺病毒载体是5型腺病毒基因重组而成的，由于其El 区的缺失，致使病毒的复制缺陷，不会引起宿主细胞的损伤或病毒扩散。展望 与其它病毒载体的不同，腺病毒载体具有许多独特的优点：①宿主范围广，对 人致病性低；②在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；③能有效进行增殖， 滴度高；④不整合到染色体，无插入突变性；⑤能同时表达多个基因。由于腺 病毒载体具有诸多优点，因此在研究中越来越多地被采用． 在前期研究的基础上，设计了以下三部分研究：(1)以肾肿瘤相关抗原G250 蛋白冲击Dc诱导特异的CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况。(2)以Ad为载 体，将G250基因转染Dc诱导CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况，并与G250 蛋白诱导组作比较分析。(3)转染Ad／G250的人树突状细胞诱导CTL抑制人肾 癌细胞系786一O裸鼠移植瘤发生与生长。通过以上三部分研究，探讨以Ad为 载体，将肾癌抗原基因转染Dc并诱导CTL，用于治疗肾癌的可行性，在此基础 之上，优化制备工艺，为临床试用于抗原明确的肿瘤治疗奠定实验室基础。 第一部分6250蛋白致敏的Dc瘤苗体外诱导特异性抗肾癌免疫 1研究方法： l。1人外周血树突状细胞的分离培养及致敏 Ficol 取健康者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(1．0771)分离 n 博士学位论文 中，在37℃，5％C仉条件下培养4～6h，收集悬浮细胞(冻存备用)。在培养板 37℃，5％C倪继续培养3d。 I．2DC表面标志的表达检测 加入PBS0．5ml，震荡悬浮细胞后上流式细胞仪分析。 1．3混合淋巴细胞反应的检测 。。 分别加入上述两组DC，