日本（虫寻）（Charybdis+japonica）血蓝蛋白的分离纯化及其酚氧化酶样生物化学性质的研究.pdfVIP

日本蜻-t(Oharybdisjaponica)rlfl蓝蛋白的分离纯化 及其酚氧化酶样生物化学性质的研究 摘要 血蓝蛋白(hemocyanin，He)是在软体动物和节肢动物血淋巴中发现的存 在于细胞外、负责运输氧的一类巨大蛋白质。很多研究表明，软体动物及节肢 有Cu2+结合位点，且在特定的条件下，Hc又能转化为酚氧化酶样酶 纯化及其HdPO的生化性质研究，不仅对于查清特定条件下Hc在无脊椎动物 非特异性免疫系统中的作用具有重要意义，而且还有助于我们对Hc肩负多重 生物学功能的认知。为了揭示甲壳动物He的HdPO生物化学性质，本文以日 S．100凝胶过滤柱层析DEAE 本蝙的血淋巴为实验材料，利用sephacryl Fast Flow离子交换柱层析技术对日本持的Hc进行了分离纯化，并以 sepharose 上．二羟苯丙氨酸(三一DOPA)为特异性底物对其HdPO生物化学性质进行了系 统研究。实验结果表明，本文所获得的4340埘280比值为0．21的日本好}k纯化 样品，在SDS．PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)中显示为分子量 分别为74．3kDa和69．1 和PO的分子量大小不同，说明本实验纯化得到的Hc没有被proPO或PO污染。 的差别，证明本文所得纯化样品确为Hc。利用体外激活剂对日本婚Hc的激活 结果显示，O．1％SDS能非常有效地将Hc转化为HdPO，异丙醇和胰蛋白酶只 1％ 能部分将Hc激活为HdPO，而尿素对Hc的激活作用很弱。为此，本文选用0 mmol／L。 底物的最适反应pH值约为7．O，最适温度约为40℃，赫，值约为2．90 底物特异性研究还发现’此HdPO不仅对L—DOPA具有氧化活性，对酪氨酸底 物也具有氧化活性，且对酪氨酸的‰值约为7．33mmol／L，但不能氧化对苯二 酚和邻苯二酚，说明该酶不仅对L．DOPA(二酚)具有氧化活性，而且对酪氨 酸(单酚)也有氧化活性，但对二酚的亲合力要高于单酚。此研究结果表明， 这种HdPO很可能是一种酪氨酸酶类型的PO，而不是漆酶或儿茶酚酶。利用 多种氧化酶特异性抑制剂对HdPO酶活性影响的研究结果发现，日本婚HdPO thiourea)和抗 对于酪氨酸酶的特异性抑制剂半胱氨酸(cysteine)、苯硫脲(phenyl sulfite)Lt 坏血酸(ascorbicacid)非常敏感，对硫脲(thiourea)和亚硫酸钠(sodium 较敏感，而对苯甲酸(benzoicacid)和柠檬酸(citricacid)不敏感，从而进一步证明 了日本蝇HdPO确为一种酪氮酸酶类型的PO。此外，HdPO对金属离子螯合剂 乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙基二硫氨基甲酸酯(DETC)及金属离子非常敏感， mmol／L 其酶活性能被EDTA、DETC和Cu2+强烈抑制，且10cu2+能完全回复 被EDTA抑制的酶活性，说明日本好的HdPO与其PO一样也是一种铜金属酶 protein)，从而也使我们更容易理解Hc在特定条件下可以转化为HdPO、在非 特异性免疫中行使与PO相似的免疫学功能。 关键词： 日本蝇；血蓝蛋白；酚氧化酶；酚氧化酶样酶；酪氨酸酶；金属酶 PURI FI OATI ONOF l HEMOCYANNFROM ica Charybdisjapon ANDBIOCHEMICALPROPERTIESOFHEMOCYANINDERIVED PHENOLOXI