糖多孢红霉菌A226-SP突变体构建及回复研究.pdfVIP

1 摘要 糖多孢红霉菌A226-SP 突变体构建及回复研究 摘要 红霉素（erythromycin ）是糖多孢红霉菌（Saccharopolyspora erythraea ）合 成的次生代谢产物，为一类广谱大环内酯类抗生素，在临床上具有广泛的应用。 第三代红霉素增强了红霉素的酸稳定性，而且对许多耐药性细菌具有杀死或抑 制作用，其结构上的最大特点是内酯环C-3 位的L-克拉定糖为酮基所取代，又 被称为酮内酯类抗生素（ketolide ）。红霉素母核中C-3 位的功能基团-OH 由其 聚酮合成酶（polyketide synthase,PKS ）模块6 中的酮基还原酶（ketoreductase, KR ）酶域决定，用基因工程方法对KR6 酶域的DNA 序列进行敲除或替换可能 会全部或部分地使KR6 失活，使C-3 位羟基变为酮基。 在糖多孢红霉菌 KR6 酶域的NADPH 结合保守区域中有两个重要氨基酸 GlyAla1142 。本文通过同源重组方法突变KR6 酶域的GlyAla1142 密码子，构建可 以合成DOEB 而不产生红霉素的糖多孢红霉菌A226 突变体，为下一步筛选有 生物活性的酮内酯类抗生素奠定了基础。 以糖多孢红霉菌基因组DNA 为模板，利用反向PCR 技术，扩增糖多孢红 霉菌KR6 酮还原酶基因突变DNA 片段SP（KR6 酶中GlyAla1142 替换成SerPro）， 克隆到载体pWHM3 上，构建染色体同源重组型质粒pWHM3-SP。在PEG3350-T 缓冲液介导下将 pWHM3-SP 转化到糖多孢红霉菌 A226 原生质体中，筛选出 pWHM3-SP 整合到红霉素合成基因上的整合体A226-1、A226-2 和A226-3 。将 筛选得到的整合体A226-1 在无硫链丝菌肽的R3M 斜面上至少生长两代后，制 备成原生质体涂R3M 平皿，对不能在含Thio 的R3M 斜面上生长并无枯草杆菌 抑制效应的菌株进行 DNA 序列分析，获得了糖多孢红霉菌 A226 的突变菌株 A226-SP 。高分辨液像色谱-质谱联用分析仪分析证实 A226-SP 突变体合成了 DOEB ，同时检测到红霉素母环合成过程中模块5 中ACP 的底物C H O ，但 18 34 6 没有发现红霉素产物。 为了验证是因为突变KR6 酶域的GlyAla1142 密码子而使KR6 失活，设计了 回复实验，来证明二次重组没有改变除已测序之外其它 DNA 的结构。根据密 I 糖多孢红霉菌A226-SP 突变体构建及回复研究 码子的偏好性，将编码Gly 的密码子由GGT 变为GGC 保证编码产物不变，构 建了同源重组型质粒pWHM3-CA，在PEG3350-T 缓冲液介导下转化糖多孢红 霉菌A226-SP 的原生质体。通过两次同源重组筛选，挑取了1 株能够恢复抑制 枯草芽孢杆菌生长的菌株，薄层层析证明该菌株能够恢复合成红霉素的功能。 说明整个重组过程没有破坏糖多孢红霉菌 A226 染色体的其他合成基因和后修 饰基因结构。 关键词：糖多孢红霉菌，酮内酯类抗生素，KR6 酶域，同源重组 II ABSTRACT Study on construction and restoration of Saccha