胶质瘤干细胞诱导巨噬细胞癌变实验研究.pdf

胶质瘤干细胞诱导巨噬细胞癌变的实验研究 中文摘要 胶质瘤干细胞诱导巨噬细胞癌变的实验研究 中文摘要 第一部分：胶质瘤干细胞体外诱导巨噬细胞癌变的实验研究 目的：将人胶质瘤干细胞与巨噬细胞共培养，观察胶质瘤细胞与巨噬细胞的相互 作用及能否诱导后者发生恶性转化，并鉴定其转化后的生物学表型。 方法：取全身表达绿色荧光蛋白的C57BL/6J-NC-GFP 裸小鼠，腹腔灌洗得到的 巨噬细胞与转红色荧光基因的人胶质瘤干细胞系SU3-RFP 直接及间接共培养，建立 双色荧光示踪细胞共培养模型，观察胶质瘤干细胞与宿主巨噬细胞相互作用，观察巨 噬细胞形态及细胞特性的变化，鉴定其生物学表型的改变。 结果：不论是直接及间接共培养，均可见巨噬细胞受肿瘤刺激后发生形态上的变 化。其中直接共培养体系中，早期可见巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。继续传代培养， 巨噬细胞由小圆形逐渐变为长梭形，并可连续传代，生长曲线表明此转化的巨噬细胞 具有同SU3 细胞相似的生长周期及生长速度，具有恶性转化细胞特性。 结论：体外双色荧光细胞共培养模型中，人胶质瘤干细胞可诱导宿主巨噬细胞恶 性转化，值得进一步深入研究。 关键词：荧光示踪；恶性转化；巨噬细胞；胶质瘤干细胞 第二部分：胶质瘤干细胞诱导宿主巨噬细胞癌变的体内研究 目的：肿瘤免疫研究表明，进展期肿瘤组织中的巨噬细胞对肿瘤生长起促进作用， 本文旨在探索胶质瘤干细胞能否在体内诱导巨噬细胞的癌变。 方法：将红色荧光蛋白基因(RFP)转入人脑胶质瘤系 SU3，建立稳定表达红色荧 光蛋白胶质瘤细胞系SU3-RFP ，然后将SU3- RFP 接种于表达绿色荧光蛋白基因(GFP) 的裸小鼠腹腔，致瘤后取腹水和肿瘤结节培养，细胞单克隆方法得到肿瘤微环境中的 各型细胞，并进行传代培养。单克隆所得到绿色荧光细胞(GFP+) ，连续传代培养后建 I 中文摘要 胶质瘤干细胞诱导巨噬细胞癌变的实验研究 立相应细胞株，在荧光显微镜下观察细胞生长情况。细胞爬片后进行HE 染色，观察 细胞形态。MTT 方法绘制此细胞生长曲线。细胞集落形成实验测定此细胞集落形成 率。将其接种于裸小鼠右前肢腋下，观察细胞致瘤性。在流式细胞仪上检测GFP+细 胞DNA 含量，细胞G 显带方法对GFP+细胞进行染色体G 显带分析，PCR 扩增cox 基因，对 GFP+细胞进行种属鉴定，免疫细胞化学方法检测GFP+细胞巨噬细胞特异 性标志蛋白CD68 的表达。 结果：SU3干细胞球因表达RFP蛋白而发红色荧光。将SU3-RFP细胞接种于GFP 裸小鼠腹腔，其致瘤能力100%，荷瘤鼠血性腹水及腹腔肿瘤结节均由发红色荧光的 SU3-RFP子代细胞和发绿色荧光的宿主细胞组成。将血性腹水或肿瘤结节的组织块在 含血清培养基中培养，都能见到发红色(RFP) 、绿色(GFP)和黄色(RFP/GFP融合)三种 不同荧光颜色的细胞。单克隆得到的GFP+细胞，体外培养证实其具有无限增殖能力， 且兼具下列癌细胞表型：增殖迅速、细胞间接触抑制消失、细胞集落形成率高、高致 瘤率。在流式细胞仪上测得其DNA合成能力是正常2倍体鼠淋巴细胞的2.528倍，为超 5倍体(2.528 ×2) 。通过G显带可计数染色体条数为92.70 ±7.15(N=10)，且为端着丝粒； 此GFP+细胞可扩增出种属特异性鼠cox基因阳性产物，另外，此GFP+细胞还表达鼠 巨噬细胞特异性标志蛋白CD68 。 + 结论：在RFP/GFP双色荧光示踪肿瘤模型中，新发现CD68 、具癌细胞特征、源 + 于宿主(GFP )腹腔巨噬细胞的肿瘤细胞，说明被肿瘤细胞征集来的巨噬细胞不但能促 进肿瘤细胞生长，而且自身已癌变，这一发现对进一步研究肿瘤组织重构和肿瘤微环 境有重要意义。 关键词：胶质瘤干细胞；荧光裸小鼠；巨噬细胞；细胞癌变 作 者：崔宝乾