中药双黄补对体外原代培养人牙髓细胞增殖和超微结构影响研究.pdf

中文摘要 中药双黄补对体外原代培养人牙髓细胞增殖和超微 结构影响的研究 摘 要 目的：牙髓细胞是牙髓组织的主体细胞，是牙体组织损 伤再生修复能力的重要成份。提高牙髓细胞增殖活性有利于 牙髓组织修复过程的顺利进行。因此，体外培养牙髓细胞， 揭示牙髓细胞的增殖、分化特性对牙髓组织的损伤修复具有 重要意义。中药作为天然药物因其具有毒副作用较小的优点 而越来越受到人们的欢迎，从天然药物中寻找新的有效药物 正成为全世界医药学的研究热点。本实验采用组织块法原代 培养人牙髓细胞，观察人牙髓细胞的生物学特性，为牙髓组 织工程的发展奠定基础。提取中药黄连、黄芩、骨碎补复合 制剂有效成分，作用于体外培养的人牙髓细胞，四唑盐比色 法(MTT)检测、超微结构下观察以阐述中药双黄补对人牙髓 细胞增殖特性的影响。最终为牙髓组织的损伤修复寻找最佳 治疗用药。 方法： 1牙髓细胞原代培养及细胞生长特性 1．1牙髓细胞原代培养和传代 选择20岁以下正畸待拔除牙或待拔除阻生智齿。口腔 常规消毒，拔牙后立即移入超净工作台。牙钳钳开，拔出牙 髓，去除根尖部2mm牙髓组织，将牙髓组织剪碎平铺于25 h～4 于培养箱，3 h后翻瓶。观察细胞游出和生长情况。待 中文摘要中父摘要 细胞长满约瓶底80％时消化传代。 1．2牙髓细胞贴壁率的测定，j 取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，以1×1 O)／ml接 O、12、14 种24孔培养板，选取2、4、6、8、1 h时的时间 点吸弃培养液，胰酶消化，计数，计算贴壁率。 1．3牙髓细胞分裂指数的测定 取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，以2×l04／m1接 种于预先放有盖玻片的12孔板中。每24h取出1张盖玻片， 连续取7d，固定，髓染色。镜下计数1 ooO个细胞中的分 裂相，计算分裂指数。 1．4绘制生长曲线 取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，以3×104／1n1接 种于24孔板，每3孔为一组，每天取一组，连续取7d，消 化计数，绘制生长曲线。 2双黄补对人牙髓细胞增殖及超微结构的影响 2．1双黄补提取液的制备 将黄连、黄芩、骨碎补按一定比例混合，水提醇沉法配 制成质量浓度每毫升含1g生药的药液，脱色、过滤。用含 2％FBS培养基稀释到相应终浓度(分别为lO¨∥ml、50 l，Lg／1nl、100 备用。 2．2MTT法检测人牙髓细胞增殖活性 取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，接种于96孔板。 随机分为6组，每组5孔，孵育72h后加入不同浓度双黄补 提取液培养基，继续孵育48h后，MTT法酶联免疫检测仪 490 mn波长测各孔OD值。 中文摘要 2’3扫描电镜观察 取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，接种于预先放有 盖玻片的6孔板中。随机分为对照组和实验组。孵育72h后 加不同浓度双黄补提取液培养基培养7d，取出盖玻片，洗 涤固定，常规制备样品，扫描电镜观察。 2．4透射电镜观察 取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，接种在50m1培 养瓶中，随机分为实验组和对照组，孵育72h后加不同浓度 双黄补提取液培养基培养7d，细胞刮刮取细胞，洗涤固定， 常规制备样品，透射电镜观察。 结果： 1原代培养 d～7 接种3 d后可见梭形、多角形细胞从组织块周围游 出，逐渐增多后，排列紧密有极性。细胞游出约2周后1：1 传代，传代后细胞生长迅速，约每周传代一次。 2牙髓细胞贴壁率． 牙髓细胞接种后成圆球样飘浮于培养液中，以后逐渐贴 4 8％。24 附伸展，接种1 h时细胞贴壁率达