1间斑寇蛛卵粒成分分离与鉴定2可溶性胶制备及其在蛋白质分析中应用.pdfVIP

摘要 1间斑寇蛛卯粒成分的分离与鉴定 间斑寇蛛(L．tredecimguttatus)属球腹蛛科、寇蛛属，是一 种中型蜘蛛，是已知世界上毒性最强的蜘蛛之一。早期的文献报道和 我们的前期研究结果发现，间斑寇蛛与其他有毒动物不同，不仅毒腺 毒液中含有各种毒性成分，其身体的其他组织(如腿、腹部等)以及 卵粒中也存在毒性成分。尽管已有零星的关于间斑寇蛛机体组织和卵 粒毒性成分研究的文献报道，但到目前为止还没有对间斑寇蛛卵粒毒 素成分进行系统分离纯化和结构与功能分析的相关报道。在本研究 中，我们采用溶液抽提方式获得卵粒提取物，然后用凝胶过滤层析和 反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法对卵粒提取物中的多肽类成分进 行了分离纯化，并对纯化产物的理化和生物学性质进行了初步研究。 间斑寇蛛卵粒提取物通过凝胶过滤层析得到7个峰。本研究主 要对P7号峰中的成分进行了进一步的分离纯化与鉴定。质谱分析表 明， P7主要由分子量小于10kDa多肽组成，主要多肽成分分布在 P7洗脱峰成分进行进一步的分离纯化得到4个主要的分离峰(命名 Da、3652．99Da、3722．28Da、3651．54Da。MALDI TOF质谱分析表 用P7一l成分按0．332 mg／kg体重的剂量进行小鼠腹腔注射没有发现 明显的中毒症状。利用离体小鼠隔神经膈肌标本进行的电生理实验证 明P7-1成分在100 pg／mL浓度下不能阻断小鼠隔标本中的神经一肌肉接 头传递。按20“g和40}tg／g体重的剂量对美洲蜚蠊进行腹部注射， 蜚蠊也没有出现明显的中毒症状。这些实验数据显示，在本研究的剂 量下P7-1成分对小鼠和美洲蜚蠊没有明显的毒性。该多肽成分的其 他生物学活性还有待进一步研究。 关键词：间斑寇蛛，卵粒，多肽，分离纯化，性质分析 2可溶性胶的制备及其在蛋白质分析中的应用 在蛋白质化学与蛋白质组学的研究当中，凝胶电泳分离与质谱分 析已成为应用最为广泛的研究技术。在这种研究策略中，电泳之后进 行的胶内酶解成为其最关键的环节，因为它涉及到把完整的蛋白质降 解成为质谱技术可以分析的大小合适的肽段。但是，传统胶内酶解有 其固有的局限性，如蛋白酶难以与凝胶深层的蛋白样品充分接触而影 响蛋白质酶解效果；此外，一些大的和／或疏水性强的肽段的回收率 低，从而影响这些蛋白质的鉴定效果。 为了克服传统胶内酶解的局限性，我们利用含有可裂解的二硫键 种可溶性凝胶并对这种凝胶的配制条件进行了优化。为了筛选出一个 能够使胶溶解的合适的DTT浓度，我们比较了不同浓度的二硫苏糖醇 (DTT)(0．14、0．12、0．1、0．08、0．06、0．04、0．02 mmol／g胶) 对胶的溶解效果。实验结果显示，除0．02mmol／g外其他浓度的DTT 都能够在56。C下水浴1．5h使胶完全溶解。为了尽可能地降低DTT 对后续蛋白质酶解的影响，我们选择0．04mmol／g胶的DTT浓度为溶 解胶的适宜浓度。利用SDS辅助溶解的BSA和细菌视紫红质 (bacteriorhodopsin，BACT)为模式蛋白，对传统凝胶和可溶性胶在 蛋白质分析中的应用进行了对比研究。两种凝胶块冻干之后分别吸入 两种蛋白样品，然后用甲醇与乙酸混合液进行胶固定化处理。重复洗 涤去除SDS和其他盐类等小分子物质。传统凝胶中的蛋白质胶内酶解 后，萃取法收集酶解肽段。可溶性胶块则利用浓度为0．04mmo]／g胶 的DTT56。C下水浴1．5 h完全溶解，对胶中的蛋白质进行液相酶解。 利用甲酸化的70％乙腈溶液沉淀凝胶使之与酶解肽段分离。质谱结果 表明，可溶性胶能有效提高蛋白质酶解的效果和酶解肽段的回收率， 从而有助于提高蛋白质鉴定的可靠性。 关键词：可溶性胶、制备、溶解、蛋白质分析、双(丙烯酰)胱胺 ABSTRACT the fromthe 1．Isolationandidentificationof componentseggs of