人乳头瘤病毒16型L1E7CTL重组杆状病毒载体构建及转染昆虫细胞.pdf

人乳头瘤病毒16型LI／E7CTL重组杆状病毒载体的构建及转染昆虫细胞 人乳头瘤病毒16型L1／E7CTL重组杆状病毒载体 的构建及转染sf9昆虫细胞 专 业：皮肤病与性病学 研究生：胡荣欣 导 师：高藻副教授 中文摘要 人乳头瘤病毒(ttPV)是人类多种疾病的致病原，能够引起包括宫颈上皮在 内的多种皮肤粘膜上皮的增殖，如宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、皮肤生殖器疣 状增生和喉乳头状瘤病等。皮肤粘膜局部发生的HPV感染还会促进人类免疫缺陷 病毒(HrV)的传播，因为局部的炎症会使皮肤产生细小的损伤，并且有淋巴细 胞和吞噬细胞浸润，这都有利于HIV进入机体并感染靶细胞。由HPV持续感染引起 的宫颈癌是死亡率极高的妇女恶性肿瘤，对患者的生理和心理造成了极大的伤 害，严重危害了人类健康。虽然早期发现，早期手术并结合化疗和放疗治疗宫颈 癌能有效缓解病情，提高患者的五年生存率，但是却使患者的生活质量大大降低， 并且不能最终清除被病毒感染的细胞，防止肿瘤复发。研究证实具有致癌性的人 乳头瘤病毒的持续感染是宫颈癌主要病因，95％以上的病例可以由ffPVl6，18，3I， 33，45和56型的感染来解释，而HPVl6ⅢIJ是癌组织内最常见的一种，检出率超过 50％，因此研制一种有效针对HPVl6的疫苗成为防治由HPVt6持续感染导致的宫颈 癌的最佳途径。大量的理论和实验资料表明，由晚期基因编码的L1衣壳结构蛋白 的c末端数十个氨基酸残基对病毒的自组装是非必须的，去除该区域后连接上60 余个外源氨基酸残基仍能自行组装成病毒样颗粒(VLPs)。自我组装形成的VLPs 在形态上与真正的病毒颗粒没有差别，并且空间构象相似，但不包含病毒性癌基 因组，因此可诱导产生有利的体液免疫反应却没有潜在的致癌危险性，以此达到 预防感染的目的。另一方面，为了有效的清除已经感染病毒的细胞，阻止其无限 增殖，刺激机体产生特异性的细胞免疫作用同样重要。作为细胞免疫反应的主要 效应细胞，细胞毒T淋巴细胞(CTL)在病毒感染时通过两种机制：细胞裂解和细 人乳头瘤病毒16型L1／E7CTL重组杆状病毒载体的构建及转染昆虫细胞 胞凋亡杀伤被感染的细胞，进而在清除病毒和阻止感染慢性化中起关键作用。研 究发现，慢性HPV感染者外周血或局部组织中存在特异性CTL，这些CTL可以识 别HPV编码蛋白中一个或多个表位。基因重组或人工合成的HPV蛋白多肽，可 在体外刺激CTL，增强其溶解HPV感染的靶细胞。更重要的是，CTL可识别细 胞内表达的HPV抗原，并对这些表达抗原的细胞有溶解作用。因此，CTL在清 除HPV感染中起重要作用。刺激产生CTL的方法很多，其中最常用的是诱导抗原 呈递细胞(APC)表达病毒抗原并与主要组织相容性复合物一同刺激OILs。大部 分HPV相关的肿瘤仅表达E6年DE7，因此治疗性疫苗的大部分工作都直接针对E6$D E7抗原。但是以往的很多研究都是针对E7或E6的全基因片段进行的，但这必然会 造成一些变异或可溶性的抗原多肽与CTL的表面受体结合，阻止CTL与被感染的 HPV靶细胞发生反应，或者与表位竞争结合靶细胞表面的MItCI类分子，使CTL 不能最大程度地发挥杀伤功能。因此，如何解决这一问题，成为研制更加有效的 治疗性疫苗的关键。 本实验对如何产生更加有效的预防和治疗性疫苗进行了探索性的研究。首先 在以往研究的基础上，利用Ll蛋白在C端缺失数十个氨基酸仍可自行组装这一特 性，选取其M1一Q471的基因片段为目的基因一。目的基因的模板来源于HPVl6标 限制性内切酶SalI，BamH年HXbaT，BamH I双酶切后逐一插入克隆载体pUtl9中， 构建出包含Ll的克隆质粒pHPVl6Ll。同时选取能最为有效激活特异性CTL反应的 单一表位E74””的基因片段为目的基因二，并将其连接到片段一的下游区域，构 建融合基因。E7957的氨基酸序列为RAHYNIVTF，通过人工合成相应的编码核苷酸 序列，并引入合适的酶切位点和翻译终止信号。将目的基因二与克隆载体pUCl9 连接后通过蓝白斑筛选和测序鉴定确定阳性重组克隆pUCl9E7CTL。再将用Sal 【和XbaI双酶切获得的Ll序列克隆入pUCl9E7CTL中，获得包含融合基