蜘蛛毒素作用受体的分离与鉴定.pdfVIP

分类号 05 密级 学校代码 10542 学号200921411034 蜘蛛毒素作用受体的分离与鉴定 Is01ationand identincationof toxin spiderreceptors 研 究 生 姓名 刘 惠 指导教师姓名、职称 至煲丝塑撞 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一二年五月 摘 要 自然界的天然毒素是人类可以利用的宝贵资源。目前，自然界的 动物毒素尤其是蜘蛛毒素已引起相关科学工作者浓厚兴趣。蜘蛛毒素 种类繁多、功能多样，在神经生物学和药理学等方面具有重要的应用 前景。近年来，对蜘蛛毒素的研究取得了重大进展，用电压钳和膜片 钳等电生理技术对许多作用于细胞膜上的电压门控离子通道如钾、 钠、钙离子通道的毒素的性质进行了分析。这些技术已成为研究毒素 作用机理的主要方法。但电压钳和膜片钳技术用于鉴定毒素的结合蛋 白质时具有一定的局限性，因为它们往往是定向的使用不同类型的离 子通道或其亚型去探测蜘蛛毒素的活性。在本研究中，我们选取一种 具有代表性的蜘蛛神经毒素虎纹捕鸟蛛毒素一I(HWTX．I)为材料，采 用基于生物素标记的策略，通过检测和鉴定HWTX．I在神经细胞质 膜上的结合蛋白(泛称受体)的方法探讨HWTX．I的功能，从而获得关 于HWTX—I作用机理的更直接的信息。 HWTX．I是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化出的一种分子量为 3．75 kDa的多肽神经毒素。它由33个氨基酸残基组成，含3对二硫 键。电生理实验表明它能可逆性阻断小鼠膈神经．膈肌标本的神经肌 肉接头传递。为了检测它在膈神经．膈肌的神经肌肉接头中的受体， 本文利用EZ．Link 大鼠膈肌细胞膜的蛋白质作用。通过两种方式分离和鉴定与 T 膜碎片孵育再用交联剂BS3进行交联，然后用含去污剂的缓冲液提 取蛋白质并用SDS。PAGE进行分离。凝胶电泳分离的蛋白质转至 PVDF膜上后用与辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白 (HI冲一avidin)检测和显影。另一种方法是先将大鼠膈肌细胞质膜的 检测和显影。对两种方法中显现的条带的蛋白质用CapLC—MS／MS进 行分析鉴定。 生物质谱和电生理技术证明本研究中制备的biotin—HWTX—I为标 记上一个生物素基团的修饰产物，生物素标记未影响其生物学活性。 约72kDa的位置显示出条带，提示该条带很可能含有HWTX—I的结 合蛋白。为了检测蛋白质中是否含有内源性抗生物素蛋白的结合位 点，我们利用未标记的HWTX．I以及不用HWTX．I的空白对照进行 了实验。结果表明两种情况下都在相同的位置有条带显现，且未标记 HWTX—I存在时的条带颜色比不用HWTX．I时的条带颜色浅。这说 明质膜蛋白质本身具有内源性抗生物素蛋白结合位点，而且抗生物素 蛋白的结合位点很可能与HWTX—I的相同或大部分重叠。在分析 性处理对HWTX—I与蛋白结合的影响，对HWTX—I与膜上蛋白质复 性处理前后的结合差异进行了比较。结果表明，对膜上蛋白质进行复 性处理后HWTX—I与蛋白质的结合增强。与此同时，我们还利用 潜在的结合位点的结合(反之亦然)，这进一步验证了aVidin和 HWTX．I在结合蛋白质中的结合位点并不完全重叠。 将HRP．avidin显现的条带中的蛋白质用胰蛋白酶消化和 电压门控Ca2+通道蛋白，电压依赖的阴离子选择性通道蛋白，Ca2+ ATP酶和膜联蛋白等，提示HWTX．I可能通过与多种膜蛋白或离子 通道蛋白作用阻断神经肌肉接头传递。 关键词：HWTX．I，生物素标记，抗生物素蛋白，神经肌肉接头， Westem印迹，受体，液相色谱串联质谱联用 ABSTRAC