基因工程制药的制造实例.ppt

第二章 第十三节;一、干扰素;现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来生产干扰素。 1.基因工程菌的组建 组建过程：分离干扰素mRNA，以mRNA为模板反转录合成cDNA，将cDNA克隆到载体中并转化大肠杆菌K12，获得干扰素基因工程菌。 所克隆的干扰素cDNA是从抗病毒活性最高的12SmRNA区域合成的。 克隆载体pBR322质粒，含有四环素和氨苄青霉素抗性基因。;pBR322质粒结构图;重组人干扰素产品;组建干扰素工程菌的流程 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得mRNA 5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA 自mRNA反转录成cDNA 双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC 退火获得杂交质粒 转化大肠杆菌K12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆 用已知干扰素的DNA片段作为探针挑选富有干扰素cDNA的克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达 ;2. 基因工程干扰素的制备;α2b干扰素生产过程;2.产品的提取与纯化 4000r/min离心30min，去上清后，湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分用溶解缓冲液进行处理，上清超滤浓缩，Sephadex G-50 分离。 经SDS检查。 再经DE-52柱纯化。;3. 质量控制标准和要求;⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清igG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。 ;3.2 成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验 ;二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。 GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残基的密码子。;重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产品;1. 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的制备;分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF发酵工艺;发酵产物收集、纯化 离心 离子交换层析或亲和层析纯化 超滤浓缩，分子筛 除菌过滤、分装、冻干 ;近年应用较多的还有融合蛋白表达GMCSF的方法。 采用ＰＣＲ方法改建人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′换用ＴＡＡ终止密码，将其克隆入多种不同表达融合蛋白的载体中，并在ｃＤＮＡ与上游细菌蛋白基因之间嵌入凝血酶接头，导入适当宿主后均获得高效表达，表达融合蛋白经凝血酶消化后释放出Ｎ－末端与天然成熟蛋白一级结构（糖基化除外）完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，经层析纯化可得到适宜人体应用的活性蛋白。 ;2. 质量控制标准和要求;三、人白细胞介素-2;天然白介素-2由396个核苷酸加上起始密码和终止密码组成，编码133个氨基酸，其中含有三个半胱氨酸（58、105和125位），第125位Cys的巯基游离，易引起IL-2分子内二硫键错配或分子间二聚体的形成，从而降低IL-2的生物活性与稳定性，同时增加其不良反应。 重组的未加改构的人白介素-2多以包含体形式表达，在变性与复性过程中易形成二硫键错配，为进一步提纯带来困难。 为解决上述问题，可将重组IL-2经过密码子突变，将第125位的半胱氨酸改为丙氨酸。;1. 重组人白细胞介素-2;重组时利用定点突变方法将天然IL-2的第125位氨基酸由Cys改为Ala（密码子由TGT变为GCT），获得新型IL-2—— 设计并人工合成两条寡核苷酸引物： 引物1：5’-AGC AAT TCC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3’ 引物2：5’-AT GGA TCC TTA TCA AGT CAG AGT CGA GAT GAT GCT TTG AGC AAA GGT-3’; PCR扩增得到0.4kb大小的DNA片段，经鉴定为含Ala125突变的IL-2基因。PCR片段用EcoRⅠ-BamHⅠ双酶切。 将表达质粒pBV220同样用EcoRⅠ-BamHⅠ酶切，并用T4DNA连接酶使之与PCR扩增的重组IL-2编码基因连接，得到重组质料pBV220/IL-2。