基因工程在发酵工程中的应用.pptVIP

第九节  基因工程在发酵工程中的应用;以天然产物为基础发展药物的方法;基因工程改造传统制药工业体现在四个方面;直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。;微生物基因工程育种;（一） 抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法;2002年5月，Bentley S.D.等在英国 Nature 报道了链霉菌的模式种天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) A3 (2)菌株的基因组全序列研究结果：基因组全序 8,667,507 bp，GC含量72.12%，7825个基因，55个假基因，基因平均长度991 bp，编码密度88.9%。;⑵ 抗生素生物合成基因成簇存在： 参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个;阿克拉霉素 每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后排列成基因簇(gene cluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。 抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。研究还发现，产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的抗菌素产量水平呈正相关。;阿克拉霉素Aclacinomycin;⑶ 少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上 如天蓝色链霉菌 3 (2)菌株中的次甲霉素A（Methylenomycin A）的生物合成基因位于SCP1质粒上。;抗生素生物合成基因群成员的结构特点 ⑴ 链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成： GC含量高达70％以上、三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高； ⑵ 抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个； ⑶ 少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上。;7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这7个方法是： 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 阻断变株法 突变克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探针法 同源基因杂交法 ;⑴ 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 “鸟枪法”克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;放线紫红素阻断突变株之间的互补测验;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;【突变克隆法原理图解】;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;⑷ 直接克隆法 抗生素生物合成基因成簇存在，总长度～30 kb，成套克隆基因簇是可能的。;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;;Eli Lilly公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一个步骤的 大环菌素-O-甲基转移酶 (Macrocin-0-methyltransferase)氨基端35个氨基酸顺序，按照密码子偏爱原则合成了44 bp的寡核苷酸探针； 用?Charon4构建弗氏链霉菌的gDNA文库，与探针逐一杂交，10个重叠克隆共涉及27 kb DNA； 与用粘粒pKC462a构建的弗氏链霉菌的gDNA文库杂交，有4个重叠克隆共包含58 kb片段，其中包括前面的27 kb片段； 进一步分析表明，58 kb DNA中编码Tylosin生物合成全部基因。;;化学结构类似的抗生素，其生物合成途径和每个合成环节的酶也相似，编码酶的基因之间存在同源性； 用放线紫红素的actⅡ和actⅣ 做探针，与24种产氨基糖苷类抗生素的链霉菌DNA杂交，可产生特异性杂交带； 用actⅡ为探针，成功地克隆了榴菌素(granaticin)和杀螨菌素(milbemycin)的生物合成基因簇； 利用红霉素的eryA1基因克隆了苦霉素(picromycin)生物合成相关基因； 利用碳霉素(carbomycin)的car E 基因克隆了麦迪霉素的4-羟基苯酰基转移酶基因；;抗生素生物合成是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成是一个复杂的，多因素的调节过程，抗生素的生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节和控制。 放线紫红素 红霉素 青霉素 链霉素;（三） 提高抗生素的产量;（三） 提高抗生素的产量;（三） 提高抗生素的产量;（三） 提高抗生素的产量;1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株 2、增加参与生物合成种限速阶段基因的拷贝数 3、发挥调节基因的作用 4、增加抗性基因的拷贝数;（四）改善抗生素组分;（五）改进抗生素生产工艺;生物合成途径中某个酶基因的突变 在生物合成途径中引入一个酶基因 利用底物特异性不强的酶催化形成新产物;;二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用㈠ 在氨