生物制药--动物细胞工程制药.ppt

生物制药;第一节 概述 第二节 动物细胞的形态和生理特性 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 第四节 动物细胞的培养条件和培养基 第五节 动物细胞培养的基本方法 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式 第七节 动物细胞生物反应器 第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 第九节 动物细胞制药的前景与展望;Robert Hooke 及其制作的显微镜;;;;二、动物细胞的化学组成和代谢;三、动物细胞的生理特点;;;第三节 生产用动物细胞的要求和获得;一、生产用动物细胞的要求;二、生产用动物细胞的获得;;;;;;;;三、基因工程细胞的构建和筛选;用杆状病毒做载体的优点;;2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选;;;如何筛选工程细胞？;四、常用生产用细胞的特性;;;;五、细胞库的建立;;;第四节 动物细胞的培养条件和培养基;一、动物细胞的培养条件;1. 器材的清洗和消毒;2. 水质;3. pH;4. 渗透压;5. 温度;6. 空气;无毒、无污染;二、动物细胞培养基的种类和组成;2.合成培养基 优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应 其组成大致如下： 氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必需氨基酸： 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。 此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重 要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来 源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基 本物质。;;;血清的主要成分;血清的种类;血清的外观;血清的作用机制;3.无血清培养基 优点： 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响； 减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险； 供应充足、稳定； 细胞产品容易纯化； 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性； 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。;无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂 添加剂大致有以下几类： 激素和生长因子： 各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合 成，对细胞生长有刺激作用。;结合蛋白：最经常被补??的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。 贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。除贴附因子（纤维结合蛋白、胶原）、多肽生长因子，有的还添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。 其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。;如何选择培养基;培养细胞的种类： 原代细胞培养 传代细胞培养 培养基不同： 液体培养 固体培养 培养容器和方式不同： 静止培养 旋转培养 微载体培养 中空纤维培养 固定化培养;一、细胞分离;消化液的用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。 常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等;二、细胞计数;血球计数板计数 ;2.血球计数板计数;结晶紫染色细胞核计数法 原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。 ;MTT染色计数法 MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。 MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。 灵敏度高；MTT有致癌性，DMSO极易渗透皮肤;三、细胞传代;贴壁细胞传代的注意事项;四、细胞的冻存和复苏;2.细胞的复苏（总的要求是快融） 注意事项： 操作中注意防护，戴面罩和手套； 从液氮中取出后，立即丢入37-40℃温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化； 用乙醇消毒安踣外表； 尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液； 隔天观察细胞生长情况，再换液一次。;一、动物细胞大规模培养的方法 二、动物细胞培养的操作方式;一、动物细胞大规模培养的方法;依培养容器和方式： 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养 中空纤维培养、 固定床或流化床培养;从生产实际分为： 悬浮培养 贴壁培养