等温滴定量热法（ITC）.docVIP

等温滴定量热技术 摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。等温滴定量热技术（ Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质折叠/去折叠蛋白质-小分子相互作用酶-抑制剂相互作用酶促反应动力学药物-DNA/RNA相互作用RNA折叠蛋白质-核酸相互作用核酸-小分子相互作用核酸-核酸相互作用生物分子-细胞相互作用n） 、反应焓变（?H）、熵变（?S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。ITC已成为研究生物大分子结合反应的有力工具。现代的ITC仪器可以测量0.1μcal (0.4 μJ)的热效应， 108–109M-1的结合常数，反应速率可以精确至10-12 mol/s，Km和kcat的测量范围分别在10-2–103mM 和0.05–500s[2]。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，ITC 的应用非常广泛，包括涉及焓变的化学和生化结合反应以及一些复杂过程，比如酶动力学。与其他的研究方法相比，ITC 不需要作任何的化学修饰或固定，可以直接地测量结合焓。许多生化反应可以在等温条件下完成，通过滴定改变样品的组成，为 ITC 提供了广阔的潜在应用前景。它对于阐明分子结合机制，结合分子结构进行药物设计等都有重要的作用。 等温滴定量热技术简介 ITC是一种热量连续变化的量热器。主要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池)和参比池、注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈系统（图1）[3]。恒温条件下当滴定进行前，首先反馈系统给样品池一个连续的能量确定基线。滴定进行时，注射器滴入反应物（通常是用小分子物质滴定大分子，本文中注射器中的反应物称作配体，ligand，L）与样品池中被滴定物（本文中被滴定的反应物称作大分子，macromolecule，M）相互作用触发结合反应，形成大分子/配体复合物（macromolecule/ligand，ML）。复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。随着池中反应趋于饱和，热量信号逐渐减弱知道只看到背景热量（图2）[2]。 图1 ITC结构示意图(2004, Current Protocols in Cell Biology) 样品池和参比池由隔热夹套包裹，注射器将滴定物注射入样品池，同时作为搅拌器，计算机控制温度控制装置和信息反馈系统。 图2 ITC的热量补偿系统（Matthew W. Freyer and Edwin A. Lewis，2008） 典型的ITC数据如图3，每次配体滴定入反应池中对应着一个峰，记录的信号是保持样品池与参比池温度恒定需要添加或移除的热量，图3表示的是一个吸热反应。每个注射峰上面对应的面积积分与每次注射吸收的热量相当。将得到的数据用软件（通常用origin软件）与合适的模型进行拟合，就能得到相应的热力学参数：结合常数KB、结合焓变?H、化学计量数n[2]。在实验温度下，有了这些热力学数据就可以根据以下两个公式充分阐明反应中的热力学变化：?G = -RT ln KB ； ?G = ?H –T?S； 另一个重要的热力学参数恒压热容（△Cp）也可以通过测量一系列温度下?H的变化获得：?Cp = d?H/dT。 图3 典型的ITC数据（2004, Current Protocols in Cell Biology） ITC操作流程 ITC实验主要包括以下步骤：（i）确定合适的反应物浓度，（ii）准备样品，（iii）滴定，收集数据，（iv）校正原始数据，（v）校正后的数据非线性回归得出热力学参数，（vi）分析模型。下面详细介绍每个步骤： （i）为了确保结合反应中热量的变化